KISS1基因免疫去勢效果及機制的研究.pdf

1、沿襲千年的手術去勢正受到規(guī)?；瘶藴驶竽辽a(chǎn)需求的挑戰(zhàn)，基因免疫去勢新技術最有希望成為替代者。下丘腦分泌的kisspeptin蛋白由KISS1基因編碼，處于生殖軸控制最上游，通過調(diào)控GnRH的分泌影響繁殖，對動物青春期起始和繁殖的控制起著至關重要的作用。本研究應用基因克隆、RT-PCR、Western blot、酶聯(lián)免疫測定、免疫組化、實時熒光定量PCR、組織HE染色等技術，選擇生殖軸最上游的KISS1基因作為靶基因構建非抗性篩選真核表

2、達質(zhì)粒pKS-asd，在細胞水平測試融合抗原KS的表達，將其免疫公羊，旨在探討KISS1基因免疫去勢的效果、機制、對生長的影響、可逆性和否安全。本研究為開發(fā)高效和低成本的免疫去勢新技術和新方法提供了理論基礎和技術支撐。
　　1.非抗性篩選KISS1真核表達質(zhì)粒pKS-asd的構建與鑒定將合成的人KISS1基因克隆到pVAX1載體上，構建pVAX1-KISS1質(zhì)粒，然后再將HBsAg-S基因克隆到pVAX1-KISS1質(zhì)粒上，構建p

3、KS質(zhì)粒，最后利用天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶（asd基因）營養(yǎng)篩選標記取代pKS質(zhì)粒中的卡那霉素(kan)抗性基因篩選標記，構建非抗性篩選KISS1真核表達質(zhì)粒pKS-asd。融合基因KS的序列、插入位點和方向經(jīng)測序和酶切鑒定表明是完全正確的;pKS-asd質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染HeLa細胞24 h后經(jīng)RT-PCR法檢測到了融合基因KS的正確轉(zhuǎn)錄;pKS-asd質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞48 h后，通過Western blot方法檢測到了融合蛋白KS的正確

4、表達。
　　2.KISS1基因免疫去勢的效果將構建的非抗性篩選KISS1基因疫苗pKS-asd和空質(zhì)粒pVAX-asd分三次，間隔三周免疫6頭8周齡公羊，到初免后的第14周進行屠宰。初免后的第4-14周，疫苗免疫組公羊可檢測到特異性的抗kisspeptin抗體;疫苗免疫組公羊睪酮濃度顯著低于對照組公羊(P＜0.05);初免后第6-14周，疫苗免疫組公羊陰囊周長均顯著低于對照組公羊(P＜0.05)，疫苗免疫組公羊睪丸重和睪丸長均顯著

5、低于對照組公羊(P＜0.05)，疫苗免疫組公羊睪丸內(nèi)精原細胞、精母細胞和精細胞的數(shù)量均明顯低于對照組公羊;疫苗免疫組公羊的性行為顯著低于對照組公羊(P＜0.05)。結論，KISS1基因免疫公羊后，誘導了特異性的抗kisspeptin抗體應答，抑制了公羊的性腺功能和性行為，達到了去勢的目的，同時，證明KISS1基因是開發(fā)免疫去勢基因疫苗的一個新靶標。
　　3.KISS1基因免疫去勢的機制①抗kisspeptin抗體特異性中和外周血中

6、的kisspeptin在初免后的第4-14周，抗kisspeptin抗體在疫苗免疫組公羊中均能檢測到，同時，在初免疫后的第6-14周，疫苗免疫組公羊血清中kisspeptin的濃度顯著低于空質(zhì)粒對照組公羊(P＜0.05)，表明KISS1基因免疫產(chǎn)生的抗kisspeptin抗體能夠特異性中和外周血中內(nèi)源性的kisspeptin，從而導致血清中kisspeptin濃度的急劇下降，達到去勢的目的。
　　②抗kisspeptin抗體穿過血

7、腦、血睪屏障直接發(fā)揮免疫中和作用在睪丸和腦組織中未能檢測到抗kisspeptin抗體的存在，表明KISS1基因免疫產(chǎn)生的抗kisspeptin抗體可能不能穿過血睪或血腦屏障而在睪丸或腦內(nèi)直接發(fā)揮免疫中和作用。
　?、跭ISS1基因免疫對KISS1基因在下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）中表達的影響疫苗免疫組公羊下丘腦、垂體和睪丸組織中KISS1基因的表達量與對照組沒有顯著差異，表明KISS1基因免疫可能不是通過影響HPG軸中KISS

8、1的合成而達到去勢的目的。
　　④KISS1基因免疫對HPG軸中GPR54基因表達的影響疫苗免疫組公羊下丘腦、垂體和睪丸組織中GPR54基因的表達量與對照組沒有顯著差異，表明KISS1基因免疫可能不通過影響HPG軸中GPR54的合成而達到去勢的目的。
　　結論，KISS1基因免疫去勢的機制可能是通過抗kisspeptin抗體特異性中和外周血中的kisspeptin，從而達到去勢的目的。
　　4.KISS1基因免疫去勢對

9、生長的影響在初次免疫后的第4-14周，疫苗免疫組公羊血清中的睪酮濃度顯著低于空質(zhì)粒對照組公羊（P＜0.05），而疫苗免疫組公羊血清中的雌激素、IGF-1和GH濃度與對照組差異不顯著。疫苗免疫組公羊胰臟和舌組織中KISS1基因的表達量顯著小于對照組，疫苗免疫組公羊胰臟組織中GPR54基因的表達量顯著小于對照組，說明KISS1基因免疫公羊后會在一定程度上影響KISS1及受體GPR54基因在消化系統(tǒng)中的表達。疫苗免疫組公羊的體重與對照組公羊無

10、論在免疫前還是免疫后差異均不顯著。綜上所述，KISS1基因免疫去勢不會影響動物的生長。
　　5.KISS1基因免疫去勢的可逆性將構建的非抗性篩選KISS1基因疫苗pKS-asd和空質(zhì)粒pVAX-asd分三次，間隔三周免疫免疫6頭8周齡公羊，到初免后第30周進行屠宰。疫苗免疫組公羊均能發(fā)現(xiàn)抗kisspeptin的抗體，此外，疫苗免疫組公羊血清中的睪酮水平顯著低于對照組公羊(P＜0.05)，隨著時間的推移，疫苗免疫組抗體水平逐步下降，

11、血清中睪酮的濃度也逐步提高。在初免后第6-22周，疫苗免疫組公羊陰囊周長均顯著低于對照組公羊(P＜0.05)，然而，在初免后第30周，疫苗免疫組公羊陰囊周與對照組公羊差異不顯著。在初免后第30周，疫苗免疫組公羊睪丸重、睪丸長和睪丸寬與對照組差異不顯著，疫苗免疫組公羊睪丸內(nèi)精子、精細胞、精母細胞和精原細胞的數(shù)量與對照組公羊差異不明顯。結論，KISS1基因免疫對動物睪丸生長發(fā)育的抑制具有可逆性。
　　6.KISS1基因免疫去勢的安全性