PAHs致男(雄)性生殖損害中端粒和線粒體損傷效應(yīng)和機(jī)制研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩124頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、研究背景:
  多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類重要的環(huán)境污染物,能通過呼吸、飲食、飲水和皮膚等多種途徑進(jìn)入人體。PAHs分布廣泛,多種PAHs化學(xué)物并具有致癌性和致突變性,被國際癌癥研究中心(IARC)劃分為很可能的人類致癌物。此外,研究發(fā)現(xiàn)PAHs及其活性中間產(chǎn)物也能影響雄性生殖功能,最終導(dǎo)致不育。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)研究均報(bào)道PAHs暴露水平升高與精液質(zhì)量下降和精

2、子DNA損傷相關(guān),增加男性不育的風(fēng)險(xiǎn)。然而,PAHs對(duì)男性生殖能力的潛在影響仍然存在不確定性,尤其是在普通人群低劑量接觸暴露中,PAHs暴露與雄性生殖損傷之間的弱效應(yīng),可能僅用常規(guī)的精液質(zhì)量難以衡量,而需要尋找環(huán)境PAHs低暴露條件下致雄性生殖損傷的更敏感的生物標(biāo)志物。此外,PAHs誘發(fā)雄性生殖毒性的分子事件及其潛在的機(jī)制仍不清楚。因此,對(duì)遺傳損傷的分子機(jī)制進(jìn)行溯源,發(fā)現(xiàn)PAHs造成生殖細(xì)胞損害的分子靶點(diǎn),將為探索反映PAHs雄性生殖損

3、害的生物標(biāo)志物提供重要的依據(jù)。
  端粒和線粒體DNA在維持基因組完整性和細(xì)胞正常生理功能中起重要作用。既往的研究表明,PAHs能誘導(dǎo)細(xì)胞端粒DNA和線粒體損傷,提示端粒和線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異??赡苁荘AHs造成雄性生殖損害的重要靶點(diǎn)。本研究中,以本課題組開展的大學(xué)生生殖健康隊(duì)列研究(MARHCS)為基礎(chǔ),分析PAHs環(huán)境暴露與精子端粒DNA和線粒體DNA損傷的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步選擇PAHs的典型代表物B[a]P及其代謝產(chǎn)物BPDE開展

4、體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探討其對(duì)雄性生殖細(xì)胞端粒和線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷效應(yīng)及其在雄性生殖損害中的作用及機(jī)制。
  研究內(nèi)容:
  1.重慶市大學(xué)生人群PAHs暴露與精子遺傳損傷和精液質(zhì)量的關(guān)聯(lián)研究
  以本課題組在2013-2015年開展的MARHCS隊(duì)列研究為基礎(chǔ),采用2014年第一次隨訪的人群(n=666)生物樣本(尿液和精液)進(jìn)行PAHs內(nèi)暴露水平和精子多項(xiàng)損傷指標(biāo)的評(píng)價(jià)。采用GC-MS檢測尿液中PAHs代謝產(chǎn)物水平,

5、熒光定量PCR檢測精子端粒長度和精子mtDNAcn,JC-1檢測精子線粒體膜電位,Long-PCR檢測mtDNA完整性,AnnexinⅤ-FITC檢測精子凋亡以及常規(guī)精液質(zhì)量指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上,分析了PAHs尿代謝產(chǎn)物與上述精子損傷相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。通過人群研究探討PAHs環(huán)境暴露致男性生殖損傷的生物標(biāo)志物。
  2.BPDE和B[a]P誘導(dǎo)生精細(xì)胞衰老和凋亡過程中端粒損傷機(jī)制研究
  建立了BPDE染毒的小鼠精母細(xì)胞株GC-2

6、模型。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率,AnnexinⅤ/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡,SA-β-Gal染色的方法檢測細(xì)胞衰老,用于評(píng)價(jià)BPDE對(duì)GC-2細(xì)胞的毒性效應(yīng);進(jìn)一步采用熒光定量PCR和末端限制片段長度分析(TRF)的方法檢測細(xì)胞端粒長度,F(xiàn)ISH結(jié)合γ-H2AX免疫熒光方法檢測端粒DNA斷裂,TRAP-PCR-ELISA檢測端粒酶活性以及Western blot檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的蛋白表達(dá)水平,用于評(píng)價(jià)BPD

7、E對(duì)GC-2細(xì)胞的端粒損傷效應(yīng)。另外,采用Western blot檢測DNA損傷反應(yīng)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),觀察BPDE對(duì)GC-2細(xì)胞內(nèi)DNA損傷反應(yīng)的激活情況。在此基礎(chǔ)上,采用shRNA-TERT和pLV-EGFP-TERT載體構(gòu)建了TERT干擾和再表達(dá)的GC-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型,研究TERT基因在BPDE誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老和凋亡中的作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,我們建立了B[a]P(0、5、10和20 mg/kg)灌胃染毒SD大鼠7天動(dòng)物模型,進(jìn)

8、一步驗(yàn)證體外GC-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
  3.BPDE誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡過程中線粒體損傷機(jī)制研究
  建立了BPDE染毒的GC-2細(xì)胞模型。采用NAO染色方法檢測線粒體質(zhì)量、RT-PCR檢測mtDNAcn的改變、JC-1檢測線粒體膜電位的變化、Western blot檢測線粒體呼吸鏈關(guān)鍵蛋白COXⅣ、轉(zhuǎn)錄共激活因子PGC-1α以及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白,如Cyt C、caspase-9、caspase-3的表達(dá)水平,以評(píng)價(jià)BP

9、DE對(duì)生精細(xì)胞的線粒體功能、線粒體生物合成和線粒體途徑凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上,采用PGC-1α激活劑ZLN005預(yù)處理GC-2細(xì)胞后,檢測BPDE對(duì)上述線粒體損傷相關(guān)指標(biāo)的影響,以明確PGC-1α在BPDE誘導(dǎo)的生精細(xì)胞線粒體損傷和細(xì)胞凋亡中的作用。此外,利用上述構(gòu)建的TERT干擾和再表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,進(jìn)一步研究BPDE誘導(dǎo)的生精細(xì)胞線粒體損傷效應(yīng),探討端粒調(diào)控與線粒體損傷之間的聯(lián)系,以明確TERT在BPDE誘導(dǎo)的生精細(xì)胞線粒體損傷中的作用

10、。
  研究結(jié)果:
  1.人群PAHs暴露與精子端粒長度和精子線粒體拷貝數(shù)的相關(guān)性
  本研究共檢測了8種PAHs尿代謝產(chǎn)物,包括1-OHNap、2-OHNap、1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe、2-OHFlu和1-OHPyr。研究結(jié)果顯示,尿中1-OHPyr和1-OHNap與精子端粒長度呈負(fù)相關(guān),1-OHPyr(β=-0.385;95%可信區(qū)間[CI]:-0.749~-0.021;1-

11、OHNap(-0.079;95% CI:-0.146~-0.011)。尿中2-OHPhe、3-OHPhe、∑Phe metabolites和2-OHFlu水平與精子mtDNAcn呈負(fù)相關(guān),2-OHPhe(-9.427;95%CI:-17.586~-0.459);3-OHPhe(-11.488;95% CI:-19.462~-2.725);∑Phe metabolites(-9.635;95%CI:-17.965~-0.688);2-OH

12、Flu(-11.692;95% CI:-19.647~-2.949)。尿中PAHs代謝物與精子線粒體膜電位和mtDNA完整性之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著關(guān)聯(lián)。此外,未觀察到這8種PAHs尿代謝產(chǎn)物與精子凋亡和常規(guī)精液質(zhì)量指標(biāo)(包括精液量、精液密度、精子總數(shù)和精子前向運(yùn)動(dòng)百分率)之間的相關(guān)性。上述結(jié)果提示,低水平PAHs暴露可能造成精子端粒和線粒體損傷,并且精子端粒長度和精子mtDNAcn改變可能作為低劑量PAHs環(huán)境暴露致男性生殖損傷的敏感指標(biāo)

13、。
  2.BPDE和B[a]P誘導(dǎo)生精細(xì)胞衰老和凋亡過程中端粒損傷機(jī)制研究
  BPDE對(duì)GC-2細(xì)胞具有顯著的毒性效應(yīng),能引起生精細(xì)胞增殖抑制、衰老和凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),BPDE處理能誘導(dǎo)GC-2細(xì)胞端粒損傷,包括端粒長度縮短,端粒DNA斷裂,以及DNA損傷反應(yīng)通路(ATM/Chk1/p53/p21)的激活。端粒酶是調(diào)節(jié)雄性生殖細(xì)胞端粒長度的重要因素,研究結(jié)果顯示BPDE處理可引起細(xì)胞端粒酶活性以及端粒酶活性限速因子T

14、ERT的蛋白表達(dá)水平的降低,提示端粒結(jié)構(gòu)和功能異常是BPDE誘導(dǎo)雄性生殖細(xì)胞損傷的靶點(diǎn)。此外,采用建立的TERT轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn),干擾TERT的表達(dá),可加重BPDE誘導(dǎo)的端粒損傷、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡以及DNA損傷反應(yīng)通路的激活,恢復(fù)TERT的表達(dá)則部分對(duì)抗了BPDE的損傷效應(yīng)。這些結(jié)果提示TERT參與介導(dǎo)了BPDE誘導(dǎo)的端粒DNA損傷相關(guān)的生精細(xì)胞衰老和凋亡。此外,體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B[a]P染毒可引起大鼠生精細(xì)胞端粒縮短,TERT蛋

15、白表達(dá)水平降低以及DNA損傷反應(yīng)的激活,并誘發(fā)睪丸毒性,包括生精細(xì)胞凋亡和衰老,睪丸組織結(jié)構(gòu)改變等,這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
  3.BPDE誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡過程中線粒體損傷機(jī)制研究
  BPDE處理引起GC-2細(xì)胞線粒體質(zhì)量降低,mtDNAcn下降,線粒體膜電位降低,線粒體生物合成和氧化磷酸化相關(guān)蛋白COXⅣ和PGC-1α的表達(dá)水平降低,線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Cyt C、caspase-9和caspase-3的表

16、達(dá)升高,表明BPDE可導(dǎo)致線粒體功能損傷和生物合成障礙。GC-2細(xì)胞預(yù)處理PGC-1α激活劑ZLN005后降低了BPDE誘導(dǎo)的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡,提示PGC-1α參與調(diào)控BPDE誘導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)的生精細(xì)胞凋亡。此外,進(jìn)一步分析BPDE誘導(dǎo)的端粒與線粒體損傷的聯(lián)系,采用TERT轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型研究顯示:TERT抑制可加重BPDE誘導(dǎo)的線粒體損傷,包括線粒體質(zhì)量、mtDNAcn、線粒體膜電位以及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá).;相反,恢復(fù)T

17、ERT表達(dá)則部分對(duì)抗了BPDE對(duì)線粒體損傷效應(yīng),提示TERT通過調(diào)控PGC-1α的表達(dá),參與調(diào)控BPDE誘導(dǎo)的線粒體損傷。
  研究結(jié)論:
  流行病學(xué)研究顯示,重慶市大學(xué)生人群中PAHs內(nèi)暴露水平與精子端粒長度縮短和精子mtDNAcn降低存在顯著的關(guān)聯(lián),提示精子端粒DNA和線粒體DNA可能是PAHs化學(xué)物造成男性生殖損傷的敏感靶點(diǎn)。小鼠精母細(xì)胞GC-2和大鼠染毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),PAHs的典型代表物B[a]P及其活性代謝產(chǎn)物

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論