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文檔簡介
1、目的:
Corin是一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶,其主要生物學(xué)功能是活化心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)。在心肌細(xì)胞中,corin將心房利鈉肽前體(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)轉(zhuǎn)化為有活性的ANP。ANP經(jīng)血液到達(dá)外周組織,與靶細(xì)胞上的A型心房利鈉肽受體(atrial natriuretic peptide receptor-A,NPR-
2、A)結(jié)合,提高細(xì)胞內(nèi)的cGMP水平,激活cGMP-依賴性蛋白激酶。在腎臟,ANP能提高腎小球?yàn)V過率,減少水鈉重吸收,抑制腎素的釋放;在外周血管,ANP有舒張血管平滑肌的作用。因此,ANP能降低血容量,維持水鈉平衡。
Corin基因敲除小鼠表現(xiàn)為自發(fā)性高血壓,而且在高鹽飲食狀態(tài)下高血壓進(jìn)一步加重。在罹患高血壓和心肌肥厚的非洲裔美國人中,有研究發(fā)現(xiàn)corin基因的單核苷酸多態(tài)性;中國高血壓病人中也發(fā)現(xiàn)有corin基因的突變。在人肺
3、癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)有corin mRNA的表達(dá)。
已有文獻(xiàn)報(bào)道,除了心臟以外,體內(nèi)有多種臟器表達(dá) corin,如骨骼、皮膚、大腦等。在以往的研究中還發(fā)現(xiàn)corin表達(dá)于小鼠皮膚的毛乳頭,corin敲除小鼠可出現(xiàn)明顯的毛發(fā)顏色改變。人類皮膚中corin的表達(dá)還未被研究。另外,corin mRNA還在人臍帶和睪丸組織中被檢測到,但具體表達(dá)的細(xì)胞還未被闡明。在妊娠期小鼠子宮中也發(fā)現(xiàn)有corin mRNA的存在。在
4、人類子宮中的表達(dá)還有待研究。
另有研究表明,在大鼠腎臟疾病模型中,腎臟組織內(nèi)corin的表達(dá)下降,同時有鈉潴留表現(xiàn)?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人類腎臟組織中corin有表達(dá)。但是,corin在人類腎小管的具體表達(dá)分布情況仍不清楚。
本課題中我們采用人體組織樣本,研究corin在多個心外臟器:臍帶、皮膚、睪丸和子宮中的表達(dá)。同時,著重研究corin在人腎小管中的表達(dá)分布和corin在腎小管上皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。還研究ANP降解酶ne
5、prilysin和corin蛋白的shedding酶ADAM10在腎小管中的分布。最后,我們還研究corin蛋白在腎極性上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)分選。這些研究將為進(jìn)一步闡明corin在心外組織中的生理功能提供理論基礎(chǔ)。
方法:
?。?)運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測人臍帶、皮膚、睪丸和子宮中corin蛋白的表達(dá)。
?。?)運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測corin蛋白、ANP和NPR-A在腎臟中的表達(dá);用原位雜交法檢測CORIN,NPP
6、A(編碼pro-ANP),NPR-A mRNA在腎臟中的表達(dá)。用免疫電鏡技術(shù)檢測corin在小鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。
?。?)在人腎臟組織中,運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測ADAM10和neprilysin的表達(dá)。將兩者與corin分別進(jìn)行雙標(biāo)記免疫熒光檢測。
?。?)將neprilysin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)corin的人胚腎293(human embryonic kidney293,HEK293)細(xì)胞,收集上清和
7、制備裂解液,運(yùn)用免疫沉淀和蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測重組corin蛋白在細(xì)胞漿內(nèi)的表達(dá)和上清中corin蛋白shedding片段的變化。
(5)研究corin在腎極性上皮細(xì)胞中的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)分選,將編碼不同長度胞內(nèi)段的corin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犬腎小管上皮細(xì)胞(Madin-Darby Canine Kidney,MDCK),免疫熒光標(biāo)記后在共聚焦顯微鏡下檢測corin蛋白在MDCK細(xì)胞膜上的分布。
結(jié)
8、果:
?。?)Corin蛋白在人臍帶、皮膚、睪丸和子宮中的表達(dá):Corin表達(dá)于臍帶的羊膜細(xì)胞、華通氏膠內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、動脈和靜脈的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在皮膚中,corin表達(dá)于皮脂腺、汗腺上皮細(xì)胞和少量間質(zhì)細(xì)胞。在睪丸中,睪丸間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、支持細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子均表達(dá)corin。在子宮中,非妊娠子宮內(nèi)膜中未見corin表達(dá),正常妊娠子宮蛻膜細(xì)胞明顯表達(dá)corin,而在子癇前期患者的蛻膜細(xì)胞中corin表達(dá)減少。
9、?。?)Corin、ANP和NPR-A mRNA和蛋白在人腎小管中的表達(dá):在腎小球,corin蛋白的表達(dá)基本為陰性。在近端小管上皮細(xì)胞中corin有很強(qiáng)的表達(dá),在遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞中corin有弱表達(dá)。在腎外髓部分,集合管和髓袢深支粗段的上皮細(xì)胞均表達(dá)corin蛋白。在腎內(nèi)髓部分,corin陽性表達(dá)的腎小管主要是集合管上皮細(xì)胞,在髓袢細(xì)段上皮細(xì)胞有弱表達(dá)。通過對corin蛋白在各腎小管的表達(dá)進(jìn)行定量圖像分析,corin在近曲小管的表達(dá)高于
10、遠(yuǎn)曲小管和集合管。ANP和NPR-A在人腎小管中的表達(dá)分布與corin的表達(dá)分布相似。免疫電鏡的結(jié)果顯示,corin表達(dá)于小鼠近曲小管上皮細(xì)胞的頂端膜區(qū)。
在 mRNA水平的原位雜交檢測結(jié)果顯示,在腎臟皮質(zhì)部分,近端小管上皮細(xì)胞中可見到高水平的corin、NPPA和NPR-A mRNA表達(dá),在遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞中三者的表達(dá)較弱。在腎髓質(zhì)部分,在集合管上皮細(xì)胞中可以見三者的明顯表達(dá)。
?。?)在人腎小球囊的壁層和臟層上皮細(xì)
11、胞中均可見neprilysin的表達(dá)。在近曲小管上皮細(xì)胞 neprilysin的表達(dá)集中于刷狀緣。其他腎小管上皮細(xì)胞中未見 neprilysin的表達(dá)。ADAM10主要表達(dá)于人腎皮質(zhì)遠(yuǎn)曲小管和髓質(zhì)集合管上皮細(xì)胞。運(yùn)用免疫熒光對腎組織進(jìn)行corin和ADAM10的雙標(biāo)記的結(jié)果顯示,corin的表達(dá)主要集中于近曲小管上皮細(xì)胞,而ADAM10主要表達(dá)于遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞。Corin和neprilysin免疫熒光雙標(biāo)記檢測顯示:neprilysi
12、n表達(dá)于近曲小管上皮的刷狀緣,corin集中表達(dá)于刷狀緣下的頂端膜區(qū)。ANP、NPR-A分別和neprilysin免疫熒光雙標(biāo)記顯示:ANP彌漫表達(dá)于近曲小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi),部分表達(dá)刷狀緣區(qū),ANP的表達(dá)與neprilysin的表達(dá)有部分重疊。NPR-A蛋白除少量表達(dá)于胞漿內(nèi)外主要表達(dá)于刷狀緣區(qū)域,刷狀緣區(qū)域NPR-A與neprilysin的表達(dá)完全重疊。
?。?)在neprilysin轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)corin的HEK293細(xì)
13、胞實(shí)驗(yàn)中,neprilysin的表達(dá)并未改變細(xì)胞裂解液中corin的表達(dá)水平和上清中corin蛋白的片段大小。
?。?)用編碼不同胞內(nèi)段長度的corin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:野生型corin蛋白表達(dá)于MDCK細(xì)胞的頂端膜區(qū);在心肌細(xì)胞(HL-1)和HEK293中,野生型corin同時表達(dá)于頂端膜區(qū)和基底側(cè)膜區(qū)。當(dāng)corin蛋白胞內(nèi)段氨基端減少30個氨基酸殘基時,部分corin蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)分選至MDCK細(xì)胞基底側(cè)膜區(qū)。
14、 結(jié)論:
?。?)本研究揭示了人類腎小管中corin、ANP和NPR-A的表達(dá)分布,提示在人腎臟中corin-ANP信號通路可能以自分泌的機(jī)制調(diào)控,而且這一自分泌機(jī)制的主要作用部位在腎近曲小管。
(2)Neprilysin對corin蛋白的shedding和降解均無明顯影響。
?。?)與corin蛋白在腎小管中的分布不同,ADAM10在人腎遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)強(qiáng)于其在近曲小管的表達(dá),提示corin在腎小管上皮細(xì)胞膜
15、表面shedding調(diào)控機(jī)制可能與心肌細(xì)胞膜表面不同。
?。?)Corin蛋白胞內(nèi)段氨基酸序列在腎極性上皮細(xì)胞中對其至頂端膜區(qū)定位有分選信號作用。
?。?)Corin蛋白在人心外臟器,如臍帶、皮膚、睪丸和子宮組織中均有表達(dá),提示corin在心外組織可能調(diào)控多種局部生理功能。目前已知,corin在妊娠子宮螺旋動脈的重塑中起重要調(diào)節(jié)作用。
綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)corin-ANP信號通路存在于人腎小管,這提示腎臟內(nèi)具有
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