一氧化氮對(duì)桃果實(shí)三羧酸循環(huán)相關(guān)酶活性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究了NO對(duì)采后肥城桃果實(shí)線粒體三羧酸循環(huán)相關(guān)酶活性的影響。在4℃條件下，用0、5、15和30μL L-1的NO分別處理6、12、18、24、30天，檢測不同NO濃度和時(shí)間處理?xiàng)l件下丙酮酸脫氫酶系和三羧酸循環(huán)中一系列相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明在整個(gè)處理期間，三種不同濃度的NO處理均可以促進(jìn)丙酮酸脫氫酶系和延胡索酸酶活性，5和15μL L-1NO處理的檸檬酸合酶活性較對(duì)照有輕微提高。30μL L-1 NO處理則很明顯地抑制了琥珀硫激

2、酶和琥珀酸脫氫酶的酶活性。15μL L-1 NO處理12天后可以促進(jìn)對(duì)順烏頭酸酶、α-酮戊二酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶酶活性，但是在前12天不同濃度NO抑制了順烏頭酸酶活性。15和30μL L-1 NO處理6天后，可以使異檸檬酸脫氫酶活性顯著升高，并且在第12和24天后迅速降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同NO處理濃度和時(shí)間對(duì)三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的活性有不同影響。
　　 另外，用毛細(xì)管電泳檢測有機(jī)酸含量表明，30和5μL L-1 NO處理分別在第

3、18和24天琥珀酸含量有顯著的積累。實(shí)驗(yàn)表明，NO可與線粒體中多種酶發(fā)生作用，通過抑制琥珀硫激酶和琥珀酸脫氫酶活性控制三羧酸循環(huán)，并且NO對(duì)琥珀酸脫氫酶活性抑制作用大于對(duì)琥珀硫激酶活性的抑制，造成琥珀酸的積累。
　　 線粒體蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶是三羧酸循環(huán)中按順序相連的兩個(gè)酶，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)和聚乙二醇沉淀法檢測mMDH和CS在中的相互作用。采用共價(jià)鍵偶聯(lián)法使11-巰基十一烷酸末端巰基與金膜形成牢固的Au-S鍵，

4、將mMDH結(jié)合在芯片上，然后在線檢測mMDH和CS的結(jié)合情況。結(jié)果表明SPR可以檢測到mMDH和CS發(fā)生相互作用，并且，NO處理后可以使相互作用加強(qiáng)。
　　 用80 mmol L-1 NO處理mMDH、CS和mMDH+CS復(fù)合物的酶活性，檢測結(jié)果表明，NO對(duì)mMDH活性沒有顯著的影響;對(duì)CS的活性有顯著的促進(jìn)作用，為對(duì)照組的3.4倍;由于mMDH和CS催化三羧酸循環(huán)中的連續(xù)反應(yīng)，對(duì)mMDH+CS復(fù)合物活性也有明顯的促進(jìn)作用，為對(duì)

5、照組的1.25倍。推測出NO可以增強(qiáng)mMDH和CS的相互作用。由于酶之間的結(jié)合形成草酰乙酸(OAA)的通路，這個(gè)通路的存在使中間產(chǎn)物可以很容易的通過兩個(gè)酶，這樣mMDH產(chǎn)生的產(chǎn)物就可以直接作為底物提供給CS，對(duì)新陳代謝的直接轉(zhuǎn)換有重要作用。
　　 圓二色譜結(jié)果表明，NO明顯改變了CS和mMDH的二級(jí)結(jié)構(gòu)。計(jì)算機(jī)模擬圖直觀的顯示了NO對(duì)mMDH和CS影響，可看出NO和CS的活性中心的Asn242形成共價(jià)鍵，存在較強(qiáng)的相互作用力;而