小麥鈣調磷酸酶B亞基類蛋白(CBL)的基因克隆及TaCBL1的功能研究.pdf

1、小麥是全球廣泛種植的主要農(nóng)作物之一，各種自然災害，如旱、澇、鹽堿等環(huán)境的急劇變化以及病蟲害,導致小麥大量減產(chǎn)。因此，提高抗逆性對于保證小麥產(chǎn)量具有非常積極的意義。
　　在植物中，很多外界環(huán)境的刺激都會引起細胞內鈣離子濃度發(fā)生變化，從而傳遞外界信息進入細胞內進而引起各種細胞內和細胞間發(fā)生響應的生理生化反應，調整自身適應外界壞境以求在嚴苛的自然環(huán)境中生存下來。作為鈣離子信號的感受器，鈣離子結合蛋白家族在植物信號轉導和抗逆過程中發(fā)揮重要

2、作用。目前，植物中已發(fā)現(xiàn)的鈣離子結合蛋白主要有三大類：鈣調素(calmodulin,CaM)類蛋白、鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)以及鈣調磷酸酶B類蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)。
　　本文旨在獲得小麥CBL基因序列，檢測其表達特性及亞細胞定位，以了解小麥CBL基因在抗逆中的作用，并對煙草進行遺傳轉化，進一步研究CBL的功能，為最終

3、培育高抗性小麥奠定基礎。本文主要獲得的主要研究結果如下：
　　(1)利用生物信息技術，將從數(shù)據(jù)庫中獲取的小麥CBL相關EST序列進行拼接,得到11條CBL基因序列(unigenes)；利用分子生物學手段成功獲得其中三個包含完整ORF(Open Reading Frame)的CBL基因cDNA，所獲得的基因所編碼的蛋白質分別與水稻的CBL1、CBL3和CBL6高度同源，因此對應的基因被命名為TaCBL1、TaCBL3和TaCBL6。

4、對蛋白質進行結構分析也發(fā)現(xiàn)，小麥中的CBL蛋白與擬南芥、水稻、楊樹、玉米等植物中相應的CBL蛋白結構極其相似。
　　(2)通過實時熒光定量RT-PCR(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)技術，分析小麥多個部位的多個發(fā)育階段中TaCBL1、TaCBL3和TaCBL6的基因表達情況，并檢測了小麥幼苗在模擬的低溫、干旱、高鹽脅迫及外源脫落酸(abscisic acid,ABA)刺激下的基因表達變化。實

5、驗結果顯示，一個TaCBL基因可以響應多種逆境，而一種逆境信號可以引起多個TaCBL基因的響應。
　　(3)分別構建了TaCBL1-GFP、TaCBL3-GFP和TaCBL6-GFP融合蛋白的表達載體并轉化洋蔥表皮細胞，在細胞膜上均觀察到了TaCBL1、TaCBL3和TaCBL6的GFP融合蛋白。
　　(4)構建了pBI-TaCBL1載體，利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法轉化煙草(Nicotiana tabacum L.cv.S

6、amsun)。通過對T2代轉基因煙草進行抗逆分析發(fā)現(xiàn)，過表達TaCBL1可以提高煙草植株的抗旱性。轉基因煙草植株的水含量提高，細胞損傷減輕，并且抗氧化能力增強。
　　以上實驗結果證明了小麥TaCBL1、TaCBL3、TaCBL6蛋白具有CBL蛋白家族的典型結構特征，參與了小麥對于逆境信號的響應；過表達TaCBL1基因可以通過增加植物抗氧化能力抵御細胞損傷，從而提高了轉基因煙草對于干旱環(huán)境的適應能力。以上實驗結果為研究和了解CBL基