具有感應(yīng)、調(diào)控尿酸濃度功能的穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選與鑒定.pdf

1、合成生物學(xué)是后基因組時(shí)代發(fā)展迅猛的一門綜合性交叉學(xué)科，它通過(guò)有目的地設(shè)計(jì)合成新的生物體和改造現(xiàn)有生物體，解決了人類發(fā)展面臨的若干重大問(wèn)題，為解決能源、健康及環(huán)境等重大問(wèn)題帶來(lái)了曙光。在合成生物學(xué)的發(fā)展歷程中，基因回路的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及應(yīng)用是重要的成就之一。伴隨著合成生物學(xué)的長(zhǎng)足發(fā)展，基因回路的功能逐步走向功能復(fù)雜和精細(xì)調(diào)控，同時(shí)不斷為人類突破藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)乃至農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的現(xiàn)有科技水平。
　　尿酸（Uric Acid）是嘌呤氧化后的產(chǎn)物

2、，它的溶解度較小，容易形成針狀的尿酸鹽晶體。正常情況下，人體內(nèi)的正常代謝保證尿酸含量處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)血尿酸濃度高于420μM稱為高尿酸血癥（hyperuricemia）。當(dāng)體內(nèi)尿酸滯留過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致人體體液變酸，影響細(xì)胞正常功能。因此，高尿酸血癥嚴(yán)重危害人類健康，進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)。
　　目前，藥物控制是治療痛風(fēng)的主要方法，但這種方法有其明顯的局限性：過(guò)去，別嘌呤醇藥物是治療痛風(fēng)的主要選擇，它在用藥安全上有著顯著優(yōu)勢(shì)但療效差強(qiáng)人意；伴隨著

3、技術(shù)的進(jìn)步，新型的生物尿酸酶制劑問(wèn)世，對(duì)尿酸濃度的調(diào)控能力得到進(jìn)一步增強(qiáng)，但此類藥物容易引起超敏反應(yīng)和耐藥。
　　隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，利用合成的基因回路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)尿酸濃度的穩(wěn)態(tài)控制成為一種新的趨勢(shì)。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，耐輻射型球菌R1（Deinococcus radiodurans R1）基因組中，hucR表達(dá) HucR；HucR是一種轉(zhuǎn)錄抑制子，hucO是它的結(jié)合位點(diǎn)；HucR在尿酸的介導(dǎo)下，能夠通過(guò)與hucO結(jié)合或分離，控制、調(diào)控h

4、ucO下游基因的表達(dá)，smUox是一種尿酸酶基因，能夠表達(dá)尿酸酶從而改變尿酸濃度。將smUox連入hucO下游，如果環(huán)境中的尿酸濃度過(guò)高，HucR與hucO解離，smUox表達(dá)尿酸酶，降低環(huán)境中的尿酸濃度；當(dāng)該濃度低至某一“臨界值”，HucR重新連接至hucO位點(diǎn)上，抑制smUox的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)尿酸濃度的穩(wěn)態(tài)控制。
　　在我們前期的研究中，人工優(yōu)化hucR得到優(yōu)化后的轉(zhuǎn)錄抑制子“mUTs”，串聯(lián)hucO得到八串聯(lián)結(jié)構(gòu)“hucO8

5、”，采用瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染的方式將“mUTs”及“hucO8”瞬時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞，選用分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）作為報(bào)告基因，構(gòu)建了雙載體尿酸感應(yīng)回路；將“mUTs”，“hucO8”以及報(bào)告基因整合至單向載體上構(gòu)建了單載體尿酸感應(yīng)回路；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種尿酸感應(yīng)回路均能夠感應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境當(dāng)中尿酸濃度的變化（0-2000μM），并且在一定范圍內(nèi)，不同理論比例的mUTs/hucO8能夠影響回路的效

6、果。
　　本研究旨在利用合成生物學(xué)的理念構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)回路對(duì)尿酸的長(zhǎng)期穩(wěn)定感應(yīng)。另一方面，在穩(wěn)定細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)回路對(duì)尿酸的長(zhǎng)期穩(wěn)定的調(diào)控，能夠迅速調(diào)控尿酸濃度至正常生理值范圍（90-420μM）。主要研究?jī)?nèi)容，方法及結(jié)果如下：
　　1、構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系p-HucO8-SEAP-mUTs，通過(guò)qPCR檢測(cè)mUTs的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，穩(wěn)定細(xì)胞系的mUTs相對(duì)表達(dá)量提高了21.8±2.6倍，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系mUTs相對(duì)表達(dá)量

7、僅升高了3.7±0.15倍。穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)過(guò)2、4、6、8、10代培養(yǎng)后mUTs相對(duì)表達(dá)量可保持在17.64±2.58倍，說(shuō)明穩(wěn)定細(xì)胞系p-HucO8-SEAP-mUTs構(gòu)建成功且穩(wěn)定性良好；
　　2、檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系在0-800μM尿酸濃度條件下SEAP的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示穩(wěn)定細(xì)胞系中SEAP的相對(duì)表達(dá)量隨著尿酸濃度的升高而逐步升高，最高達(dá)到對(duì)照細(xì)胞系的2.8±0.21倍（800μM）；在穩(wěn)定細(xì)胞系培養(yǎng)過(guò)程中，每隔24h改變環(huán)境中

8、的尿酸濃度并檢測(cè)SEAP相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，SEAP的相對(duì)表達(dá)量能夠特異地反映培養(yǎng)環(huán)境中尿酸的濃度且可逆性良好。
　　3、在穩(wěn)定細(xì)胞系培養(yǎng)過(guò)程中，每隔24 h改變環(huán)境中的尿酸濃度（0-800），SEAP相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果顯示，SEAP的相對(duì)表達(dá)量能夠特異地反映培養(yǎng)環(huán)境中尿酸的濃度，不受之前環(huán)境中尿酸濃度的影響。結(jié)果表明，該穩(wěn)定細(xì)胞系可用于尿酸濃度的重復(fù)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了回路在細(xì)胞水平上對(duì)尿酸的穩(wěn)態(tài)感應(yīng)。
　　4、選擇smUox

9、為下游基因，構(gòu)建載體p-HucO8-smUox-mUTs，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，構(gòu)建單載體尿酸調(diào)控回路，檢測(cè)其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中尿酸濃度的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)尿酸具有調(diào)控作用，能在24h內(nèi)將800μM尿酸降至573.06±8.59μM。
　　5、采用p-hucO8-smUox，pcDNA3.1/V5-mUTs，共轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中尿酸的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)24h后對(duì)較高濃度尿酸（6

10、00/800μM）具有顯著的調(diào)控作用，可降低尿酸濃度至（441±0.37/635±1.29μM）但無(wú)法將其降至正常生理值范圍內(nèi)。
　　6、以載體p-hucO8-smUox為基礎(chǔ)，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建得到3株穩(wěn)定細(xì)胞系p-HucO8-smUox（C3，D3，D4）。進(jìn)一步瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體pLV-mUTs-mCherry，考察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定株調(diào)控尿酸濃度水平的差異。結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定株Trans-C3相較于穩(wěn)定株Trans-D3