負載吲哚菁綠的介孔硅納米探針在肝癌術中精準導航方法的研究.pdf

1、目前的肝臟腫瘤治療方法主要有(1)手術治療;(2)肝臟移植;(3)化學藥物治療;(4)消融療法;(5)中醫(yī)中藥治療以及以上方法的聯(lián)合治療。目前手術治療被認為是首選的最有可能治愈肝癌的方法。如果我們通過手術能把整個實體瘤完全切除，那么腫瘤患者是可以治愈的。仍需要投入大量的科研來尋找更多的能夠用于近紅外熒光手術導航儀的熒光分子探針。
　　在本實驗研究中，我們針對近紅外熒光手術導航下，手術切除肝臟腫瘤研究的熱點問題，利用具有良好生物相容

2、性的多介孔二氧化硅(mesoporous silicalnanoparticals，MSNs)硅球材料作為分子探針的載體，用ICG作為近紅外熒光染料，并用RGD多肽進行靶向修飾后構建成能夠主動靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光探針，并建立人肝癌皮下腫瘤裸鼠模型、人肝癌原位腫瘤裸鼠模型和人乳腺癌轉移性肝癌裸鼠模型，探討靶向探針的生物適應性，主動靶向性，靶向成像效果和術中實時熒光手術導航的應用價值。
　　研究目的:
　　本研究的

3、目的是制備一種主動靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光納米探針，可以在術中實時的精確定位肝臟腫瘤的位置和邊界，為術者在術中實時提供客觀的手術切緣參考，實現(xiàn)精準的熒光手術導航切下切除腫瘤。
　　研究方法:
　　1.多介孔硅球的合成和觀察
　　水熱合成法合成多介孔硅球，掃描電鏡和透射電鏡觀察多介孔硅球的形貌和大小;粒度儀檢測多介孔硅球的水合粒徑與粒徑分布特征。
　　2.主動靶向探針的合成與化學表征
　　將吲哚菁綠

4、超聲震蕩上載入多介孔硅球中，聚乙二醇修飾后，加入RGD多肽溶液制備成主動靶向αvβ3受體的近紅外熒光納米探針(ICG/MSNs-RGD)。掃描電鏡和透射電鏡觀察靶向探針的形貌和大小，粒度儀檢測探針水合粒徑與分布;熒光分光光度計檢測靶向探針及ICG的發(fā)射光譜與激發(fā)光譜。
　　3.探針毒性實驗、體外靶向探針靶向能力的觀察
　　用MSNs和靶向探針(ICG/MSNs-RGD)孵育HepG2肝癌細胞后，再用MTT法評估MSNs和靶向

5、探針的毒性;將αvβ3受體高表達的MDA-MB-231-GFP乳腺癌細胞和αvβ3受體低表達的MCF-7乳腺癌細胞分別用靶向探針(ICG/MSNs-RGD)孵育1小時，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution，PBS)液沖洗干凈后，近紅外體式熒光顯微鏡觀察兩種細胞攝取靶向探針的情況;
　　4.皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，原位肝臟腫瘤裸鼠模型和乳腺癌肝轉移癌裸鼠模型的建立
　　取20只5-6周雄性BALB/

6、c裸鼠，取含1×107/mL HepG2-GFP細胞懸液接種于裸鼠左腋部皮下，建立裸鼠皮下肝臟腫瘤裸鼠模型。
　　在無菌條件下麻醉裸鼠，經劍突下5mm處豎直切口開腹部暴露肝臟，沿肝臟被膜下進針，緩慢推入50μL含1×107/mL HepG2-GFP或MDA-MB-231-GFP細胞懸液，逐層關腹，同樣方法建立10只5-6周雄性BALB/c裸鼠原位模型或10只5-6周雌性BALB/c乳腺癌肝臟轉移裸鼠模型。
　　5.在體研究靶

7、向探針的主動靶向功能
　　取8只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，隨機分成兩組（每組4只），一組為對照組，經尾靜脈注射非靶向探針(ICG/MSNs)150μL(0.2 mg/mL);一組為靶向探針組，經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD)150μL（0.2 mg/mL）。在注射后，的10min，12h，24h，48h，72h，96h和120h用IVIS200分子影像系統(tǒng)觀察探針在體分布情況。其中，在24h時，每組分別取一只荷瘤裸鼠，

8、脫頸處死，取腫瘤，心臟，肝臟，脾臟，腎臟等重要臟器，觀察探針在各重要臟器的分布情況。同時用IVIS活體成像軟件3.0分析腫瘤區(qū)域探針代謝數據并繪制曲線。
　　6.探針在皮下肝腫瘤邊界的精準定位的應用
　　取3只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL)48h后，用近紅外體式熒光顯微鏡系統(tǒng)進行熒光手術導航定位腫瘤位置和邊界，同時用腫瘤自帶綠色熒光作為定位腫瘤位置和邊界

9、的參考標準。術后將腫瘤標本切片后行HE染色，在病理切片水平，用近紅外體式熒光顯微鏡系統(tǒng)定位腫瘤邊界與HE染色結果對比，確定近紅外熒光導航系統(tǒng)在宏觀和微觀上均可以精準的定位腫瘤邊界。
　　7.探針對于微小皮下肝臟腫瘤的手術導航的應用
　　取12只皮下肝臟腫瘤裸鼠模型，經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL)48h后，分成兩組，每組6只，兩位臨床醫(yī)師在遵循最大限度的切除腫瘤的同時盡最大努力

10、保留正常組織的條件下，分別對6只荷瘤裸鼠進行腫瘤切除，醫(yī)師在憑借視診、觸診的主觀判斷腫瘤已經切除完全后，用近紅外熒光體式熒光顯微鏡系統(tǒng)對手術區(qū)域進行檢查，評估是否仍有微小腫瘤的殘余。如果有微小腫瘤的殘余，在近紅外熒光體式熒光顯微鏡系統(tǒng)輔助下繼續(xù)進行腫瘤切除，直到腫瘤切除干凈。最后所有腫瘤標本均進行病理切片觀察。
　　8.探針對于肝臟微小原位轉移灶的精確診斷及手術導航切除
　　取原位肝癌裸鼠模型小鼠3只，經尾靜脈注射靶向探針（

11、ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL）48h后，將小鼠麻醉，經腹正中線開腹暴露肝臟，在近紅外熒光手術導航系統(tǒng)導航下，輔助術者定位肝臟腫瘤位置和腫瘤邊界，完成肝臟原位腫瘤的手術切除，然后再行腹腔探查。
　　9.探針對于肝臟轉移癌及腹腔轉移癌的診斷及手術導航切除
　　取乳腺癌肝臟轉移裸鼠模型3只，經尾靜脈注射靶向探針(ICG/MSNs-RGD，150μL，0.2 mg/mL)48h后，將小鼠麻醉，經腹正中線開

12、腹暴露肝臟，在近紅外熒光手術導航系統(tǒng)導航下，輔助術者定位肝臟轉移癌位置和邊界，完成肝臟轉移癌的手術切除，然后再行腹腔探查。
　　10.組織病理驗證
　　將腫瘤組織利用冰凍切片包埋劑（optimum cutting temperature OCT）進行包埋和連續(xù)切片，然后將組織切片用蘇木素和伊紅(H&E)染色法進行染色固定。
　　11.統(tǒng)計學分析
　　連續(xù)變量采用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組組間整體比較

13、采用重復測量資料的方差分析;單因素組內比較采用完全隨機設計資料的方差分析;單個時間點比較應用兩獨立樣本的t檢驗。數據分析應用IBM SPSS19.0軟件進行分析， P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，繪圖及表格軟件應用Prim5.0.
　　研究結果:
　　1.介孔硅球呈規(guī)則的球形，粒徑約為100nm，分散性良好。靶向探針I(yè)CG/MSNs-RGD保持規(guī)格的球形，粒徑約為100nm，分散性良好;激發(fā)波長(780nm)和發(fā)射波長(8

14、37nm);與ICG相比，發(fā)生了3-4nm的紅移。
　　2.MTT毒性實驗結果表明MSNs和靶向探針I(yè)CG/MSNs-RGD具有良好的生物相容性;體外靶向探針特異性評估實驗中，在近紅外體式熒光顯微鏡觀察到探針I(yè)CG/MSNs-RGD孵育后的αvβ3受體高表達的MDA-MB-231-GFP乳腺癌細胞內熒光強度比αvβ3受體低表達的MCF-7乳腺癌細胞內強，MDA-MB-231-GFP細胞攝取了更多的探針I(yè)CG/MSNs-RGD。

15、r>　　3.在體靶向探針代謝實驗中，探針組皮下荷瘤裸鼠在注射探針10min，12h，24h，48h，72h，96h和120h后，腫瘤區(qū)域的熒光值隨著時間的推移逐漸消退，腫瘤區(qū)域與周圍正常組織的熒光強度對比值在48h時最大（4.92±0.2），可以選擇為最佳手術時間點。在離體腫瘤和器官水平上，可見探針主要分布在腫瘤區(qū)域。
　　4.靶向探針在術中可以給術者提供清晰的腫瘤位置和腫瘤邊界，為術者提供一個客觀的腫瘤邊界參考。
　　5.

16、在探針對于微小皮下肝臟腫瘤的手術導航的應用實驗中，兩位手術醫(yī)師都可以定位和切除直徑為5.01±2.08 mm的大腫瘤。通過近紅外體式熒光顯微鏡的輔助，兩位醫(yī)師分別發(fā)現(xiàn)肉眼無法發(fā)現(xiàn)的微小殘余癌癥2個和3個，直徑在0.95±0.07 mm。切除的總共腫瘤數目為17個，HE染色確定均為腫瘤組織。
　　6.在探針對于原位肝癌裸鼠模型的實驗中，經尾靜脈注射靶向探針48h后，經腹正中線開腹暴露肝臟，并用近紅外體式熒光導航系統(tǒng)輔助術者切除腫瘤，

17、5.09±2.31 mm大小的腫瘤肉眼均能判斷，但是0.4±0.21 mm微小轉移灶通過導航系統(tǒng)能夠判斷，與周圍正常組織的對比度(Tumor to background，TBR)為4.7±0.21。在應用近紅外體式熒光導航系統(tǒng)對腹腔進行探測，發(fā)現(xiàn)肉眼未能發(fā)現(xiàn)的微小癌灶有5個，大小約為1mm，腫瘤區(qū)域與正常組織的對比度為TBR=5.23±0.82。
　　7.同樣，在乳腺癌肝臟轉移模型中，經尾靜脈注射靶向探針48h后，經腹正中線開腹暴

18、露肝臟，并用近紅外體式熒光導航系統(tǒng)輔助術者切除腫瘤，對于乳腺癌肝轉移的腫瘤模型，探針在整個腫瘤內積聚。提供給術者一個清晰的腫瘤定位和腫瘤邊界。
　　研究結論:
　　合成的主動靶向整合素αvβ3受體的近紅外熒光探針，具有良好的生物適應性，對整合素αvβ3受體具有良好的特異靶向性;在手術過程中實時的輔助術者精準定位腫瘤位置和邊界，同時提供良好的信背比。輔助術者在手術中準確定位腫瘤邊界和實時的定位亞毫米微小腫瘤（原位腫瘤或轉移腫瘤