吲哚菁綠介導(dǎo)的熒光分子影像精準(zhǔn)識(shí)別壞死組織的研究.pdf

1、ICG是一種小分子熒光物質(zhì)。它可以在一定波長(zhǎng)的外來(lái)光激發(fā)下，釋放出近紅外波譜的熒光。這種熒光和可見光相比具有更優(yōu)異的組織穿透能力，能更好的應(yīng)用于活體成像。因而，近年來(lái)ICG廣泛的被應(yīng)用于動(dòng)物和人體的光學(xué)成像。在此基礎(chǔ)上，我們的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)了:ICG由于自身的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，經(jīng)靜脈注射后，通過(guò)其在機(jī)體內(nèi)與脂蛋白和磷脂的相互作用，能實(shí)現(xiàn)對(duì)壞死組織的靶向標(biāo)定。雖然ICG已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床40余年，但它的這一特性卻一直未被發(fā)現(xiàn)和闡明。進(jìn)一步

2、的，我們通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)室的、在體的和體外的試驗(yàn)初步探索了ICG親和壞死組織的機(jī)理，還改進(jìn)了ICG靜脈給藥的方式，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)信背比的大幅提高。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)自行改裝的熒光顯微鏡的協(xié)助，我們實(shí)現(xiàn)了近紅外熒光影像導(dǎo)航下的裸鼠壞死組織清除手術(shù)。在術(shù)中，近紅外熒光信號(hào)充分顯示了其高靈敏度和對(duì)壞死邊界界定的精準(zhǔn)性。
　　目的：
　　ICG靶向機(jī)體壞死組織的特性，結(jié)合其快速的臨床轉(zhuǎn)化能力，可以被廣泛的應(yīng)用于壞死相關(guān)疾病的診斷和更為精準(zhǔn)的

3、個(gè)體化治療。
　　方法：
　　試劑:ICG采購(gòu)自丹東醫(yī)藥有限責(zé)任公司。該藥已經(jīng)被批準(zhǔn)在臨床使用。胎牛血清(FBS)購(gòu)買自北京生物技術(shù)公司。磷脂酰膽堿購(gòu)(PC)買自Sigma北京有限責(zé)任公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)為自行配制。
　　細(xì)胞水平的機(jī)制探索:同代的4T1乳腺癌細(xì)胞（由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈(zèng)送）用于比較游離ICG和ICG+脂蛋白(LP)分別與活細(xì)胞和壞死細(xì)胞的親和性。通過(guò)使用無(wú)菌純水使細(xì)胞水腫壞死。在顯微鏡下觀察直

4、到確認(rèn)細(xì)胞水腫、破裂壞死。以1μg/ml的濃度，將ICG分別溶解于PBS和FBS中，再將這兩種溶液與活的4T1細(xì)胞一同孵育30分鐘。其后用PBS液洗脫ICG和ICG+LP3次。壞死細(xì)胞碎屑經(jīng)離心沉淀后，去除上清液，再分別加入上述兩種溶液孵育30分鐘。離心后去除上清液，加入PBS液混勻后離心，重復(fù)3次，以去除未結(jié)合的ICG。然后，將上述的活細(xì)胞和細(xì)胞碎屑在我們改造的熒光顯微鏡下拍攝可見光和熒光圖像。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。分子水平的機(jī)制探索:

5、ICG以1μg/ml的濃度分別溶解于PBS和FBS液體。將ICG的PBS溶液200μl加入96孔板的第一個(gè)孔;ICG的FBS溶液200μl加入96孔板的第二個(gè)孔;第三個(gè)孔在200μl ICG+FBS中加入飽和的PC。上述加樣過(guò)程重復(fù)兩次，分別加樣在對(duì)應(yīng)成分的下方。整個(gè)加樣及測(cè)試過(guò)程環(huán)境溫度均為37℃。將96孔板放置于小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(IVIS)的視野內(nèi)，自動(dòng)拍攝其近紅外熒光。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):所有的動(dòng)物試驗(yàn)均經(jīng)過(guò)了南方醫(yī)科大學(xué)珠江

6、醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。動(dòng)物在拍攝影像和手術(shù)時(shí)均采用異氟烷氣體麻醉。處死動(dòng)物采用水合氯醛腹腔注射。動(dòng)物包括Balb/c裸鼠和，Sprague—Dawley(SD)大鼠。雌性裸鼠用于建立乳腺癌模型，其余裸鼠均為雄性。
　　術(shù)中的熒光手術(shù)導(dǎo)航的臨床前驗(yàn)證試驗(yàn):3只燒傷壞死模型小鼠，于術(shù)前24小時(shí)靜脈注射ICG0.5mg/kg體重。術(shù)中，先由外科醫(yī)師行切痂術(shù)，再用改裝后的熒光顯微鏡導(dǎo)航殘余壞死組織的清除。3只耐甲氧西林金黃色葡萄球菌性裸鼠

7、皮下膿腫模型。術(shù)前24小時(shí)給予ICG注射。術(shù)中先由外科醫(yī)生手術(shù)清除膿腫。再在熒光顯微鏡下檢測(cè)和導(dǎo)航殘余壞死組織的清除。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用GraphPad Prism5軟件。比較兩組數(shù)據(jù)采用Student'st檢驗(yàn)。SBR值描述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。規(guī)定P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　ICG靶向壞死組織的機(jī)理研究
　　1、細(xì)胞水平的機(jī)理探索
　　ICG的PBS溶液與活的4T1細(xì)胞

8、共同孵育后，在體式熒光顯微鏡下，細(xì)胞均發(fā)出近紅外熒光，說(shuō)明ICG在水溶液中的游離狀態(tài)下，能夠與細(xì)胞膜表面的成分結(jié)合。
　　ICG的PBS溶液與壞死的4T1細(xì)胞碎屑共同孵育后，在體式熒光顯微鏡下，所有細(xì)胞碎屑均發(fā)出近紅外熒光，說(shuō)明ICG在水溶液中的游離狀態(tài)下，能夠與不完整的細(xì)胞碎屑結(jié)合。
　　2、分子水平的機(jī)理探索
　　在ICG+PBS組、ICG+FBS組和ICG+FBS+PC組，IVIS系統(tǒng)檢測(cè)獲得的近紅外熒光強(qiáng)度顯示

9、:ICG+FBS+PC組的熒光強(qiáng)度平均值比ICG+FBS組高出105.84％，P＜0.001)。說(shuō)明PC和脂蛋白的復(fù)合物和ICG的相互作用，明顯提升了ICG的發(fā)光效率
　　ICG靶向壞死組織的在體和體外規(guī)律的探索
　　1、燒傷壞死模型和缺血壞死模型上的規(guī)律探索
　　(1) ICG注射后燒傷壞死模型的熒光特點(diǎn)
　　在ICG靜脈注射后的24小時(shí)內(nèi)，測(cè)量的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)感興趣區(qū)和對(duì)照感興趣區(qū)的圖像和光強(qiáng)值。可見在ICG

10、注射的初期。壞死組織的光強(qiáng)值是低于正常組織的，但是隨著時(shí)間的推移，壞死組織的熒光消減速度在逐步下降，而正常組織的熒光強(qiáng)度消減得更加快速。
　　(2) ICG注射后缺血—再灌注壞死模型的熒光特點(diǎn)
　　在ICG靜脈注射后的24小時(shí)內(nèi)，測(cè)量的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)感興趣區(qū)和對(duì)照感興趣區(qū)的圖像和光強(qiáng)值。可見在ICG注射的初期。壞死組織的光強(qiáng)值就已經(jīng)高于正常組織，隨著時(shí)間的推移，壞死組織的熒光消減速度在逐步下降，而正常組織的熒光強(qiáng)度消減得更加

11、快速。
　　2、TTC壞死組織染色法結(jié)果與熒光結(jié)果的比對(duì)
　　按前述方法進(jìn)行標(biāo)本處理和TTC染色后，將染色后的標(biāo)本放置于我們改建的體式熒光顯微鏡下檢測(cè)并拍攝可見光和熒光的圖像。可以明顯的看出，熒光影像的范圍，邊界和TTC染色后標(biāo)本的白色部分（即壞死部分）是完全吻合的。能增強(qiáng)壞死組織信背比的ICG注射方法.
　　1、4T1乳腺癌自發(fā)性壞死模型的驗(yàn)證試驗(yàn)
　　裸鼠4T1腫瘤壞死模型的癌腫標(biāo)本經(jīng)剖開后，在體式熒光顯微鏡

12、下觀察。發(fā)現(xiàn)腫瘤的中心區(qū)域有不規(guī)則的近紅外熒光信號(hào)，而腫瘤內(nèi)的外圍區(qū)域沒(méi)有明顯的熒光信號(hào)。經(jīng)TTC壞死染色法處理后的標(biāo)本，在顯微鏡下，其紅色區(qū)域（活組織）沒(méi)有ICG熒光信號(hào);其白色區(qū)域（壞死組織）與ICG釋放的近紅外熒光信號(hào)完全吻合。
　　2、裸鼠左側(cè)腦組織激光燒傷模型的驗(yàn)證試驗(yàn)
　　裸鼠左側(cè)腦組織激光燒傷模型（圖5:b），經(jīng)冰凍切片機(jī)剖開后，在體式熒光顯微鏡下觀察。左側(cè)近顱骨處有球形近紅外熒光團(tuán)，其他部位腦組織無(wú)熒光信號(hào)。

13、經(jīng)TTC壞死組織染色法染色后的腦標(biāo)本，除左側(cè)近顱骨處有一團(tuán)塊狀腦組織呈現(xiàn)白色（壞死組織）外，其余腦組織呈紅染。而近紅外熒光信號(hào)與腦組織的白色區(qū)域完全吻合。
　　3、SD大鼠胃潰瘍模型的驗(yàn)證試驗(yàn)
　　SD大鼠的胃潰瘍模型在剖開胃大彎后，平鋪于體式熒光顯微鏡下觀察。經(jīng)放大后仔細(xì)尋找，很難快速的定位微小潰瘍病灶的位置。經(jīng)近紅外影像顯示后，立即在全黑的胃組織背景中，顯示出直徑在0.6mm級(jí)別的熒光團(tuán)。然后再在同一位置用可見光圖像觀察

14、，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有一處“火山樣”的疑似病灶。其位置與熒光團(tuán)所在位置一致。其后，將該標(biāo)本制作成的H&E染色后的病理切片，在體式熒光顯微鏡下檢測(cè)。熒光信號(hào)所在的區(qū)域與切片組織中的壞死區(qū)域完全吻合，邊界清晰。6只大鼠潰瘍直徑的平均值:1.0±0.3mm，其中能偵測(cè)到的最小的潰瘍病灶，直徑只有0.6mm。
　　4、肝臟局部壞死模型的驗(yàn)證試驗(yàn)
　　裸鼠的肝臟無(wú)水酒精消融壞死模型的肝臟整體標(biāo)本，被放置于體式熒光顯微鏡下觀察。近紅外熒光所在的位

15、置與與肉眼可以辨識(shí)的黃白色壞死區(qū)域在同一位置，但近紅外光影像的范圍要大于肉眼辨識(shí)的壞死組織范圍。其后，將將該標(biāo)本制作成的H&E染色后的病理切片，在體式熒光顯微鏡下檢測(cè)。結(jié)果顯示:H&E染色識(shí)別的壞死區(qū)域與ICG熒光的分布完全一致。甚至在一圈壞死組織環(huán)繞的一小塊正常組織也沒(méi)有熒光信號(hào)。
　　術(shù)中的熒光手術(shù)導(dǎo)航的臨床前驗(yàn)證試驗(yàn):
　　1、燒傷壞死模型近紅外熒光導(dǎo)航手術(shù)
　　在燒傷模型手術(shù)中，醫(yī)師憑借肉眼在目鏡直接觀測(cè)下，切

16、除燒傷痂皮。當(dāng)醫(yī)師主觀認(rèn)為壞死組織已經(jīng)清除完成后。再在熒光下檢視，發(fā)現(xiàn)仍然有熒光殘余。進(jìn)而在熒光導(dǎo)航下繼續(xù)清除帶有熒光的物質(zhì)，直至熒光影像呈現(xiàn)為完全黑色影像。
　　2、細(xì)菌性皮下膿腫模型近紅外熒光導(dǎo)航手術(shù)
　　在皮下膿腫模型手術(shù)中，切開皮膚，無(wú)菌棉簽拭去膿液后，醫(yī)師在目鏡下觀測(cè)，主觀認(rèn)為膿液已經(jīng)清除完全。再用熒光圖像導(dǎo)航，發(fā)現(xiàn)仍然有菲薄的一層壞死組織和正常組織貼附緊密，無(wú)法拭去。故醫(yī)師在熒光導(dǎo)航下用金屬刮匙清除全部熒光物質(zhì)，

17、直到熒光影像成為全黑狀態(tài)。
　　結(jié)論：
　　1、ICG靶向機(jī)體壞死組織的機(jī)理，經(jīng)過(guò)初步探索以后結(jié)論是:ICG經(jīng)靜脈注射后，與血液中的脂蛋白結(jié)合，然后該復(fù)合物透過(guò)壞死周圍不完整的血管內(nèi)皮間隙，到達(dá)壞死組織。復(fù)合物選擇性的與壞死組織中的磷脂疏水端結(jié)合，而不與正常細(xì)胞表面的磷脂親水端結(jié)合。
　　2、經(jīng)過(guò)我們對(duì)ICG靜脈注射方法的改進(jìn)，即將相同劑量的ICG用更緩慢的速度注射到血液系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)讓更多的ICG脂蛋白復(fù)合物進(jìn)入壞死