疫霉菌一個新病原相關(guān)模式分子PsXEG1的鑒定和功能分析.pdf

1、大豆疫霉是引起大豆根腐病并能快速擴(kuò)展造成大豆毀滅性病害的一種病原菌。它不僅在中國甚至在全世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅著大豆的生產(chǎn)安全。大豆疫霉隸屬于卵菌，在形態(tài)上，大豆疫霉雖然同真菌相似，但在進(jìn)化上卻和硅藻及藍(lán)藻關(guān)系較近，所以針對于真菌設(shè)計的殺菌劑往往對大豆疫霉無效;同時農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中無毒基因進(jìn)化速度之快使得抗病育種難以長時間發(fā)揮作用。防治大豆疫霉引起的病害是大豆生產(chǎn)中的重要難題，開發(fā)高效持久的抗卵菌病害策略是關(guān)乎農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，甚至國家命運(yùn)

2、的大事。
　　植物與病原菌互作過程中，植物通過先天免疫系統(tǒng)能夠識別病原菌的病原相關(guān)模式分子（pathogen/microbe-associated molecular patterns，PAMP），觸發(fā)自身的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI），從而抵抗大部分病原菌的侵染。病原相關(guān)模式分子是在一系列微生物中廣泛存在，且對微生物的適應(yīng)和生存起著重要作用的一類非常保守的物質(zhì)。在卵菌中，目前鑒定到的病原相關(guān)

3、模式分子有β-葡聚糖(β-glucans)、七葡萄糖糖苷(heptaglucoside)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（transglutaminase，Pep13）、結(jié)合纖維素的激發(fā)子凝集素(cellulose-binding elicitor lectins，CBDs)、激發(fā)素(elicitins)和壞死誘導(dǎo)蛋白(NLP)。但是，植物如何識別卵菌的病原相關(guān)模式分子來抵抗卵菌侵染還有待進(jìn)一步研究。在卵菌中鑒定新的病原相關(guān)模式分子，并探究其觸發(fā)植物免

4、疫的機(jī)制，將在理論上有助于理解植物的抗病機(jī)制，實(shí)踐上有助于抗病品種的開發(fā)和利用。因此，本文對大豆疫霉的病原相關(guān)模式分子進(jìn)行了系統(tǒng)的挖掘，并對鑒定到的一個新的病原相關(guān)模式分子PsXEG1在植物與病原物互作過程中的功能及其可能的機(jī)制進(jìn)行了分析，獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　大豆疫霉糖基水解酶GH12(Glycoside Hydrolase12)蛋白PsXEG1是一個新的病原相關(guān)模式分子。本文通過液相色譜在大豆疫霉的培養(yǎng)液中純化到能在

5、本氏煙上誘發(fā)細(xì)胞死亡的蛋白。通過對該蛋白進(jìn)行質(zhì)譜測序，鑒定到幾個誘發(fā)細(xì)胞死亡的候選蛋白。通過蛋白注射以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化方法在本氏煙中表達(dá)這些候選蛋白，發(fā)現(xiàn)Ps109681(PsXEG1)能在本氏煙中觸發(fā)細(xì)胞死亡，而且PsXEG1是未被報道過的蛋白，表明PsXEG1是一個新的激發(fā)子。PsXEG1還能在番茄、辣椒和大豆中誘發(fā)植物的細(xì)胞死亡，表明PsXEG1在不同植物上具有激發(fā)活性的廣譜性。PsXEG1的信號肽缺失突變體不能在本氏煙中誘

6、發(fā)細(xì)胞死亡，說明信號肽對PsXEG1發(fā)揮其激發(fā)子活性是必需的，這表明PsXEG1作用于植物質(zhì)外體觸發(fā)植物的細(xì)胞死亡。酶活性測定實(shí)驗(yàn)顯示，PsXEG1具有木葡聚糖酶水解活性，而PsXEG1喪失酶活性的突變體仍然能在本氏煙上觸發(fā)細(xì)胞死亡，表明PsXEG1誘發(fā)植物細(xì)胞死亡的能力不依賴于其水解酶活性。PsXEG1不能在沉默NbSerk3/Bak1的本氏煙上誘發(fā)細(xì)胞死亡，表明PsXEG1誘發(fā)植物細(xì)胞死亡的能力依賴于NbSerk3/Bak1受體蛋白

7、的識別。PsXEG1能夠在沉默LeEIX2的番茄上誘發(fā)細(xì)胞死亡，說明PsXEG1誘發(fā)的細(xì)胞死亡不依賴于LeEIX2的識別作用，這進(jìn)一步表明PsXEG1是一個不同于EIX(Ethylene-inducing xylanase)的一類新的激發(fā)子。PsXEG1蛋白處理本氏煙能抑制辣椒疫霉侵染表明植物識別PsXEG1能觸發(fā)植物的免疫。PsXEG1同源蛋白在卵菌、真菌和細(xì)菌中廣泛存在，并且其激發(fā)子活性在卵菌和真菌中廣泛存在，表明PsXEG1代表的

8、糖基水解酶GH12蛋白是一類新的病原相關(guān)模式分子。
　　植物通過識別PsXEG1蛋白的N端PsXEG120-53(PXN1)觸發(fā)免疫反應(yīng)。本文對PsXEG1在卵菌、真菌和細(xì)菌中的同源蛋白序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)PsXEG1這類蛋白中存在三個保守區(qū)段:PsXEG120-53、PsXEG1211-241和PsXEG1117-159。其中PsXEG120-53是位于N端的保守區(qū)段，PsXEG1211-241和PsXEG1117-159分別

9、是包含保守酶活位點(diǎn)的區(qū)段。PsXEG1蛋白的刪除突變體實(shí)驗(yàn)顯示，PsXEG1誘發(fā)植物細(xì)胞死亡的能力依賴于蛋白的完整性，而對于蛋白的不同區(qū)段而言，PsXEG1蛋白的N端對其誘發(fā)過敏反應(yīng)的能力起決定性作用。體外合成PsXEG120-53、PsXEG1211-241和PsXEG1117-159三個肽段試驗(yàn)顯示，PXN1(PsXEG120-53)能誘發(fā)植物活性氧的積累、防衛(wèi)基因的表達(dá)和本氏煙對煙草疫霉菌的抗性。不能在本氏煙上誘發(fā)細(xì)胞死亡的PsX

10、EG1同源蛋白，其N端替換成PXN1后具備了誘發(fā)細(xì)胞死亡的能力，表明PXN1是植物識別PsXEG1蛋白的關(guān)鍵區(qū)域。PsXEG1蛋白N端氨基酸位點(diǎn)突變試驗(yàn)以及PsXEG1蛋白突變體的三維結(jié)構(gòu)分析顯示，PsXEG1蛋白N端的芳香族氨基酸和親水性氨基酸對PsXEG1誘發(fā)的過敏反應(yīng)起決定性作用，進(jìn)一步表明這些氨基酸可能是植物識別PsXEG1的潛在位點(diǎn)。
　　PsXEG1在大豆疫霉侵染大豆過程中的雙重功能:致病毒力因子和病原物相關(guān)模式分子。

11、植物病原菌的水解酶通?？梢越到庵参锏拇蠓肿游镔|(zhì)提供自身需要的營養(yǎng)，或者產(chǎn)生一些有毒的次生代謝產(chǎn)物，這些過程都可以幫助病原菌進(jìn)行侵染。為了確定PsXEG1在大豆疫霉侵染過程中的作用，本文對PsXEG1在大豆疫霉菌絲、游動孢子、休止孢、萌發(fā)的休止孢和12個不同侵染時間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，PsXEG1在大豆疫霉侵染大豆黃化苗初期明顯上調(diào)表達(dá)，表明PsXEG1可能參與了大豆疫霉侵染初期的致病過程。大豆疫霉中沉默和過表達(dá)PsXEG1均

12、降低大豆疫霉致病力，表明PsXEG1參與大豆疫霉的致病過程。PsXEG1的過表達(dá)轉(zhuǎn)化子在侵染位點(diǎn)誘發(fā)了活性氧的積累和胼胝質(zhì)的沉積，表明大豆疫霉侵染大豆過程中PsXEG1能誘發(fā)植物的PTI。PsXEG1蛋白體外處理大豆黃化苗誘發(fā)大豆對大豆疫霉的抗性，表明大豆識別PsXEG1誘發(fā)的PTI免疫反應(yīng)能抑制大豆疫霉的侵染。大豆疫霉RXLR效應(yīng)蛋白在本氏煙和大豆上都能抑制PsXEG1觸發(fā)的過敏反應(yīng)，并且部分效應(yīng)分子也在侵染初期上調(diào)表達(dá)，表現(xiàn)出和Ps