氫抑制脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　脊髓損傷常導(dǎo)致患者肢體癱瘓，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡。由于目前還沒有有效的治療手段，逐年增加的脊髓損傷患者已成為世界各國重大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。僅根據(jù)美國相關(guān)調(diào)查報(bào)道，每年用于脊髓損傷患者治療和護(hù)理的費(fèi)用就超過70億美元，而且患者的平均年齡為31.7歲，15至25歲為發(fā)病高峰年齡段，后期還需要長久的治療和護(hù)理?？梢娂顾钃p傷治療的研究有著極其重大的社會(huì)意義。
　　脊髓損傷的病理過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，脊髓的繼發(fā)性損傷在原

2、發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)生，缺血再灌注損傷和炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素、自由基和炎癥介質(zhì)等引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的病理基礎(chǔ)。
　　研究發(fā)現(xiàn)，氫具有中和自由基的作用。由于其電中性，容易滲透細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜，氧化后生成水，且在清除自由基的同時(shí)不會(huì)造成機(jī)體氧化還原代謝的紊亂，能有效改善心、腦、肝、肺、腎等重要臟器的缺血再灌注損傷。用氫治療動(dòng)物脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemic reperfusion

3、injury，SCII)的研究相對少見，2014年本課題組在氫水治療動(dòng)物（新西蘭大白兔）脊髓缺血再灌注損傷的研究基礎(chǔ)上發(fā)表文獻(xiàn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)氫水治療后，動(dòng)物神經(jīng)功能明顯改善，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯下降，氫能降低氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，獲得有效的治療效果，與相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果相一致。
　　氫除了具有還原自由基的功能外，可能還通過其他途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。現(xiàn)有文獻(xiàn)資料均未對氫抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行明確的探討，因此，氫作為一種有效治療脊髓損傷的

4、潛在藥物，對其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制的研究顯得尤為必要。
　　目前關(guān)于氫抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的研究較少，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)氫可以增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表達(dá)及減少活性氧族(reactiveoxygen species，ROS)的表達(dá)，具有抗炎抗氧化作用。Zhao Y等在2014年研究發(fā)現(xiàn)氫鹽水可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS

5、)對心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減少心肌組織中GRP78、caspase-12及Bax等凋亡蛋白的表達(dá)、增加抗凋亡因子Bcl-2水平有關(guān)。Chen ZF等研究發(fā)現(xiàn)H2S可以增加抗氧化酶SOD的表達(dá)及減少ROS的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起到抗炎、抗氧化作用。Li C等在2016年發(fā)表的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)H2S可以抑制氧葡萄糖剝脫/再恢復(fù)（oxygen-glucose deprivation/restoration，OGD/R

6、）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。H2S與氫都具有相同的成分氫分子，因此在脊髓損傷的治療作用中，氫可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　PC12細(xì)胞是一組由大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆而來的細(xì)胞系，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特性，且具有可傳代特點(diǎn)，因此分化的PC12細(xì)胞常作為體外細(xì)胞模型用來研究神經(jīng)元細(xì)胞的生理、生化功能。Vavilis T等在2015年研究發(fā)現(xiàn)，OGD可以通過調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞

7、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，促使PC12細(xì)胞自我吞噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了體外模擬脊髓缺血再灌注損傷的病理生理過程并探索氫抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，我們應(yīng)用OGSD/R(oxygen-glucose-serum deprivation/restoration)模型誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，通過凋亡模型的建立及明確氧糖血清再恢復(fù)后細(xì)胞凋亡的時(shí)間窗，為氫干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并進(jìn)一步驗(yàn)證氫是

8、否能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路抑制PC12細(xì)胞凋亡。
　　方法:
　?。ㄒ唬㏄C12細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及鑒定
　　PC12細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫（高分化型）。PC12細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇、貼壁并增殖，傳至第三代取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)傳代的細(xì)胞在生物倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。
　?。ǘ?shí)驗(yàn)分組
　　第一部分:正常組（正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)組（OGSD12h/R0-6h）
　　第二部分:

9、正常組（正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞），對照組（OGSD/R組，僅氧糖血清剝脫/再恢復(fù)，無干預(yù)），氫治療組（于復(fù)氧復(fù)糖復(fù)血清即刻給予氫干預(yù)）
　?。ㄈ㎡GSD/R模型的建立
　　將PC12細(xì)胞置于低糖不含血清的DEME培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)板置于三氣培養(yǎng)瓶中(94％ N2+5％ CO2，1％ O2)中培養(yǎng)，12h后取出細(xì)胞并換成高糖DEME培養(yǎng)基，于復(fù)氧復(fù)糖復(fù)血清后不同時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄細(xì)胞凋亡情況及相關(guān)蛋白檢測。
　　（四）氫

10、培養(yǎng)基的制備
　　無菌操作下，向鋁袋內(nèi)注入高糖DEME培養(yǎng)基，4℃保存。實(shí)驗(yàn)前取出培養(yǎng)基，利用高壓通氣裝置，通入過濾氫氣(0.4MPa，6h)，使氫氣充分溶解在培養(yǎng)基中達(dá)到飽和狀態(tài)（濃度＞0.6mmol/L）。氫氣每三天補(bǔ)充以維持其飽和濃度，配好的氫培養(yǎng)基放于4℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)前取出。
　　（五）免疫熒光檢測
　　第一部分:于OGSD12h/R0-6h取不同時(shí)間點(diǎn)行細(xì)胞DAPI染色，鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡情況并拍照。

11、r>　　第二部分:于OGSD12h/R1h對三組細(xì)胞行DAPI染色，鏡下觀察細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡率。
　?。┘?xì)胞活性檢測
　　應(yīng)用CCK8檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞相對活性并行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組細(xì)胞活性差異。
　　（七）流式細(xì)胞學(xué)方檢測細(xì)胞凋亡率
　　流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率并行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組細(xì)胞凋亡變化及差異。
　　（八）細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測
　　應(yīng)用H2DCF-DA探針檢測氫干預(yù)

12、后三組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析并行相關(guān)數(shù)據(jù)收集。
　?。ň牛┫嚓P(guān)凋亡蛋白檢測
　　Western-blot法檢測caspase-3,caspase-12,PERK-eIF2α-ATF4,CHOP/GADD153水平的表達(dá)，比較各組凋亡相關(guān)蛋白的水平表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬┘?xì)胞經(jīng)傳代后，在倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)完整，長出類似交感神經(jīng)元樣的突起，細(xì)胞體積增大呈梭形，彼此相互連接交錯(cuò)。

13、>　　（二）為了更好的觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化，我們對正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞及復(fù)氧復(fù)糖復(fù)血清后0-6h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞行DAPI染色，結(jié)果提示在正常未處理的PC12中細(xì)胞凋亡幾乎不存在，經(jīng)過氧葡萄糖血清剝脫12h后PC12細(xì)胞凋亡增加。給予氧糖血清再恢復(fù)后PC12細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加，細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，在氧糖血清再恢復(fù)后1h時(shí)細(xì)胞凋亡最重。通過細(xì)胞活性檢測及流式細(xì)胞學(xué)分析并行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果與DAPI染色結(jié)果相一致。
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14、stern-blot方法檢測凋亡蛋白caspase-3，caspase-12的表達(dá)結(jié)果提示，在正常未處理的PC12細(xì)胞中caspase-3，caspase-12的表達(dá)比較低，氧葡萄糖血清剝脫后PC12細(xì)胞中的caspase-3，caspase-12被誘導(dǎo)活化，表達(dá)增加。經(jīng)過氧糖血清再恢復(fù)后，caspase-3，caspase-12的表達(dá)進(jìn)一步增加，細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重。Caspase-12的含量在氧糖血清再恢復(fù)后1h達(dá)到峰值。Caspas

15、e-3的含量在氧糖血清再恢復(fù)后2h達(dá)到峰值。兩種凋亡蛋白的表達(dá)趨勢基本一致。
　?。ㄋ模┰谘跆茄逶倩謴?fù)時(shí)預(yù)先給予氫處理能夠減少PC12細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活。通過細(xì)胞DAPI染色及細(xì)胞活性檢測，結(jié)果提示在氧糖血清恢復(fù)1h時(shí)，氫治療組細(xì)胞形態(tài)較對照組完整，凋亡細(xì)胞較少，細(xì)胞活性明顯高于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。行Western-blot方法檢測各組PC12細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3，casp

16、ase-12，CHOP/GADD153及p-PERK，p-eIF2α，ATF4蛋白水平表達(dá)結(jié)果提示，正常未處理的空白組PC12細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3，caspase-12，CHOP/GADD153及p-PERK，p-eIF2α，ATF4蛋白水平表達(dá)較低，對照組細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3，caspase-12，CHOP/GADD153及p-PERK，p-eIF2α，ATF4蛋白表達(dá)較高，細(xì)胞損傷較重。經(jīng)過氫

17、預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3，caspase-12，CHOP/GADD153及p-PERK，p-eIF2α，ATF4蛋白水平表達(dá)較對照組明顯降低，且各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　氧葡萄糖血清剝脫可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡，并在氧糖血清再恢復(fù)后導(dǎo)致PC12細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，OGSD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有時(shí)間依賴性。預(yù)先給予氫處理可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，