四株具漆酶活性的細(xì)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究.pdf

1、根據(jù)抗銅特性和使用活性染色方法，從武漢武昌黃金橋山和江漢油田附近多年生樹木根部土壤中篩選到四株具漆酶活力的細(xì)菌。凝膠活性染色表明它們都能夠氧化漆酶底物DMP和ABTS，但不能氧化酪氨酸。 利用16SrDNA序列分析法，結(jié)合常規(guī)細(xì)菌形態(tài)學(xué)分析，對四株細(xì)菌進(jìn)行鑒定，確定菌株531和575屬于赫氏菌屬(Ochrobactrum)，菌株593屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，而菌株601屬于克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，

2、并分別將這四株細(xì)菌命名為Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575、Pseudomonassp.593和Klebsiellasp.601。 Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575和Pseudomonassp.593三個(gè)菌株的漆酶活性需要銅離子的誘導(dǎo)，其銅離子的誘導(dǎo)作用不能被Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、和Mg2+代替。Klebsiellasp.601菌

3、株的漆酶活性需要銅離子的誘導(dǎo)，相同濃度的Ca2+、Mn2+、Fe2+、和Mg2+具有相似的誘導(dǎo)作用，但Zn2+則沒有誘導(dǎo)作用。在使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生漆酶需要在培養(yǎng)基中加入大于50μMCuSO4。當(dāng)培養(yǎng)基中銅離子濃度超過400μM時(shí)，細(xì)菌生長變慢，顯示高濃度銅離子對細(xì)菌生長有抑制作用。 活性染色時(shí)染色液的pH對四株細(xì)菌漆酶的活性有明顯的影響。膠內(nèi)活性染色分析表明，當(dāng)使用DMP作底物時(shí)，Ochrobactrumsp

4、.531、Ochrobactrumsp.575和Klebsiellasp.601在pH5.0到pH7.5之間顯示酶活性。當(dāng)染色液pH低于5.0時(shí)，不顯示DMP-氧化活性。用ABTS作底物時(shí)，Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575和Klebsiellasp.593僅在pH4.0-4.5之間顯示漆酶活。當(dāng)染色液pH大于4.5則不顯示酶活性。與上述三株細(xì)菌酶活不同，無論是用DMP還是ABTS作底物，Pseu

5、domonassp.593在pH5.0到7.0范圍內(nèi)，都顯示酶的氧化活性，并在pH6.0處顯示最強(qiáng)的酶活力。無論是DMP還是ABTS用作底物，對照用的蘑菇粗提液只在pH4.0左右顯示漆酶活力。當(dāng)pH大于4.5時(shí)則不顯示酶活性。 分別用4-100℃的不同溫度處理四株細(xì)菌粗提物30分鐘，然后在pH5.0條件下進(jìn)行DMP膠內(nèi)活性染色。結(jié)果顯示：(1)四株細(xì)菌在均能耐受60℃高溫處理。2以4℃時(shí)的酶活性為100﹪酶活力。在60℃處理3小

6、時(shí)，Ochrobactrumsp.531和Ochrobactrumsp.575仍保持50﹪以上酶活力，而Ochrobactrumsp.575和Klebsiellasp.601在70℃處理30分鐘仍保持40﹪酶活。(2)四株細(xì)菌粗提物分列在pH3-10的不同條件下透析20小時(shí)，然后在pH5.0條件下進(jìn)行膠內(nèi)DMP-氧化活性染色。在pH5.0-10.0處理?xiàng)l件下，Ochrobactrumsp.531和Ochrobactrumsp.575細(xì)菌

7、漆酶仍保持80﹪酶活；pH6.0-10.0條件下處理，Pseudomonassp.593細(xì)菌漆酶的相對活性在80﹪以上；pH5.0-10.0條件下處理，Klebsiellasp.601細(xì)菌漆酶也保持70﹪以上漆酶活力，且在pH3.0-4.0處理?xiàng)l件下，仍然保持30﹪以上酶活。 使用硫酸銨沉淀、Q-Sepharose層析和凝膠回收方法，對四株細(xì)菌進(jìn)行了初步純化。部分純化的四株細(xì)菌漆酶蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離，估測的蛋白的分子量