用DNAshuffling技術(shù)解除AroG的苯丙氨酸反饋抑制.pdf

1、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，Phe)是人和動(dòng)物的必需氨基酸之一，是目前全球普遍允許使用的甜味劑(Aspartame)的制造原料之一，并且其代謝與人類(lèi)遺傳疾病如苯丙酮尿癥，黑尿癥和白化病有關(guān)，因此Phe代謝研究始終是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。Phe生物合成的路徑長(zhǎng)，耗能大，產(chǎn)率低，因此生產(chǎn)成本高，價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)所需產(chǎn)品長(zhǎng)期依賴(lài)進(jìn)口，所以構(gòu)建能用于直接發(fā)酵L-苯丙氨酸的高產(chǎn)菌株具有重大的實(shí)際意義，因此本論文的工作也將圍繞獲得苯丙氨酸

2、高產(chǎn)菌的目的展開(kāi)。
　　aroG基因編碼的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)是苯丙氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化限速步驟E4P和PEP反應(yīng)生成DAHP，受苯丙氨酸反饋抑制。此前本實(shí)驗(yàn)室研究人員通過(guò)定點(diǎn)突變Escherichia coli(E.coli)K-12 aroG基因的方法獲得了可以解除反饋抑制的優(yōu)勢(shì)突變株。本論文在此基礎(chǔ)上，以E.coli aroG野生型基因，可以解除反饋抑制的突變基因，以及Salmone

3、lla typhimnrium(S.typhimnrium)aroG野生型基因?yàn)橛H本，通過(guò)DNAsuffling的方法對(duì)AroG進(jìn)行改組，得到大量的aroG突變基因庫(kù)。
　　通過(guò)使用苯丙氨酸類(lèi)似物對(duì)氟苯丙氨酸(pFP)的篩選，我們獲得了4株能夠于10 mg/ml pFP平板生長(zhǎng)的突變株(EC2、EC4、EC6和EC8)，而在同樣條件下培養(yǎng)的野生型菌株不能生長(zhǎng)，因此這4株菌是已初步解除苯丙氨酸的反饋抑制突變株。對(duì)這突變株的aroG基

4、因進(jìn)行測(cè)序和序列分析，結(jié)果表明突變體Ec2發(fā)生了4個(gè)堿基突變，Ec6發(fā)生了4個(gè)堿基突變，Ec4有6個(gè)堿基突變，Ec8有7個(gè)點(diǎn)突變。對(duì)應(yīng)氨基酸也發(fā)生了變化。其中Ec2突變基因的 T430G，T431C，T662C堿基突變?yōu)閮蓚€(gè)點(diǎn)突變aroG親本改組產(chǎn)生，T222G為新引入的突變。EC6突變基因的 T662C堿基突變與親本點(diǎn)突變同，T287C，G703A，G989A為新引入的突變。EC4突變基因的C449T，T644G，G645C堿基突變?yōu)?/p>