苯丙氨酸生物合成通路多酶基因協(xié)同表達研究.pdf

1、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）是人體所需的必需氨基酸，在醫(yī)學、營養(yǎng)學、食品加工及動物飼養(yǎng)領域均有應用。苯丙氨酸還是生產甜味劑阿斯巴甜（Aspartame）的關鍵原料，目前市場需求日益增加。我國缺乏先進高效的L-苯丙氨酸（L-Phe）生產技術，主要依靠進口，因此利用分子生物學技術構建L-苯丙氨酸高產工程菌具有現(xiàn)實意義。
　　本研究通過設計、優(yōu)化酶基因的間隔調控序列（Intergenic regulatory sequ

2、ence），使L-Phe生物合成代謝通路上下游的關鍵酶基因pheA、aroF和ppsA協(xié)同表達，從而達到提高L-Phe產量：⑴分別設計酶基因pheA、aroF和ppsA的調控序列，構建單基因重組質粒，其中成功構建的重組子 pTrc-99a-pheA，pTrc-99a-aroF單基因酶蛋白獲得高表達；⑵構建pheA和aroF酶基因串聯(lián)重組質粒pZE12-AF，改變兩個串聯(lián)基因間隔調控序列后得到了重組子pZE12-RBS-AF，將這兩個重組

3、質粒轉入營養(yǎng)缺陷菌 MG△pheA…aroF中，成功構建了工程菌 MG△pZE12-AF和MG△pZE12-RBS-AF；⑶構建三個酶基因pheA、aroF和ppsA串聯(lián)重組質粒pZE12-AFP，調整ppsA的調控序列后的重組子pZE12-RBS-AFP，并成功構建相應工程菌MG△pZE12-AFP和MG△pZE12-RBS-AFP。
　　利用SDS-PAGE觀測酶蛋白表達量，調整多酶基因AF的間隔調控序列，二基因重組質粒pZE

4、12-RBS-AF的酶蛋白比pZE12-AF表達量高；同樣，AFP三基因重組質粒中，pZE12-RBS-AFP質粒調整了ppsA的間隔調控序列，酶蛋白比pZE12-AFP表達量也明顯增多。測定工程菌發(fā)酵培養(yǎng)液上清中 L-Phe的含量，MG△pZE12-RBS-AF工程菌 L-Phe的產量比 MG△pZE12-AF提高了1.5倍；MG△pZE12-RBS-AFP的產量比 MG△pZE12-AFP也提高了2倍。MG△pZE12-RBS-AF