丹參中迷迭香酸生物合成途徑的苯丙氨酸支路基因的克隆及研究.pdf

1、迷迭香酸(Rosmarinicacid)是生藥丹參(SalviamiltiorrhizaBung.)的重要水溶性活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性。隨著丹參藥材臨床使用的不斷擴(kuò)大，市場對丹參藥材的需求越來越大。從上世紀(jì)70年代開始，人們開始嘗試采用不同的方法提高目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的含量，開展生物合成代謝研究是提高次生代謝物的有效成分的方法之一。近年來對迷迭香酸生物合成途徑的研究表明，該生物合成途徑包括兩條平行的苯丙氨酸支路和酪

2、氨酸支路，包括幾步酶促反應(yīng)，兩條支路的產(chǎn)物4-香豆酰Co-A和3，4-二羥基苯乳酸在迷迭香酸合成酶(RAS)的作用下生成迷迭香酸。在丹參中迷迭香酸生物合成途徑并未得到最終證實(shí)。不少植物中迷迭香酸的生物合成酶已經(jīng)被分離克隆，而丹參中該途徑的基因很少有研究。 本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAendsRACE)技術(shù)，首次成功的從丹參嫩葉中分離克隆出丹參迷迭香酸生物合成途徑中苯丙氨酸支路上

3、的肉桂酸-4-羥化酶SmC4H(cinnamate-4-hydroxylase)的全長cDNA序列和基因組DNA序列以及苯丙氨酸解氨酶SmPAL(phenylalanineammonia-lyase)的全長cDNA序列。對各基因的研究如下： 1.SmC4H基因：根據(jù)其他物種中的C4H的序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物克隆出丹參的SmC4H的全長cDNA序列及基因組DNA序列。兩者之間的序列比對結(jié)果表明，該基因含有三個(gè)外顯子和兩個(gè)

4、內(nèi)含子。該cDNA序列全長1800bp，包含一個(gè)完整的1512bp的開放閱讀框(OpenReadingFrame)，編碼504個(gè)氨基酸組成的前體蛋白。對該基因進(jìn)行的氨基酸水平的比對表明，該基因與藿香的C4H相似性達(dá)到94.7％，一致性達(dá)到89.7％。一步法RT-PCR分析內(nèi)源植物激素信號分子及外界刺激對SmC4H表達(dá)量的影響情況表明：脫落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和紫外照射(UV-B)處理與對照組相比，均上調(diào)SmC4H轉(zhuǎn)錄水平

5、的的表達(dá)，其中以UV-B的影響最大，而氯化鈣(CaCl2)和雙氧水(H2O2)的處理對SmC4H的表達(dá)無影響。RT-PCR分析該基因在根、莖和葉中的表達(dá)量的結(jié)果表明：該基因在根、莖和葉均中有表達(dá)，在根和莖中的表達(dá)水平較高，在葉中的表達(dá)較低。 2.SmPAL基因：該基因cDNA序列全長2354bp，包含一個(gè)長度為2133bp的ORF區(qū)，編碼含有711個(gè)氨基酸殘基的蛋白，氨基酸水平比對結(jié)果以及蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測表明：該基因?yàn)榈⒅械腜