苯丙氨酸羥化酶基因新突變的體外表達(dá)研究.pdf

1、目的：苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hyroxylase,PAH)基因6 種突變R270G、P275A、F121L、A156P、E183G 和I324N 均為錯(cuò)意突變,是由本科檢出并報(bào)道的新突變,R408Q 為已報(bào)道突變。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外表達(dá)的方法對(duì)這7 種突變進(jìn)行功能分析,通過(guò)檢測(cè)其mRNA 水平、蛋白水平及酶活性水平的變化和BH4 反應(yīng)性分析，探討其突變效應(yīng)和致病性質(zhì)，進(jìn)一步明確基因型和表型之間的關(guān)系。
　　 方

2、法：（1）應(yīng)用體外定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建含有7種突變型PAH cDNA的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證。（2）將含有野生型和突變型PAH cDNA的真核表達(dá)載體pcDNA3.0瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA和總蛋白，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA、免疫印記法檢測(cè)蛋白表達(dá)量并進(jìn)行酶活性分析。以野生型PAH作為參照，計(jì)算突變型PAH的mRNA水平和蛋白的相對(duì)表達(dá)量、殘余酶活性。（3）轉(zhuǎn)染后5 h分別更換

3、不含BH4的DMEM培養(yǎng)基和含20 mg/L BH4的DMEM培養(yǎng)基,檢測(cè)mRNA和蛋白表達(dá)量并進(jìn)行酶活性分析，觀察野生型和突變型PAH的BH4反應(yīng)性。
　　 結(jié)果：（1）突變型PAH R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、I324N和R408Q 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為野生型的133％，75％，337％，386％,125％,115％和181％；（2）相對(duì)于野生型PAH，加入BH4 前后突變型PAH 蛋

4、白相對(duì)表達(dá)量分別為：R270G ：10.5％→16％, P275A ：56.6％→122.3％, F121L ：54.3％→150.5％, A156P ：8.7％→20.7％,E183G ：8.5％→14％, I324N：67.3％→142.5％，R408Q:85.4％→155.8％；（3）加入BH4 前后突變型PAH 的殘余酶活性分別為：R270G :7.7％→19.3％,P275A:27.6％→52.6％,F121L:19.0％→6

5、0.9％, A156P:10.4％→14.6％,E183G:9.1％→23.8％,I324N:50.6％→109％, R408Q:40.2％→111.4％。
　　 結(jié)論：（1）相對(duì)于野生型PAH，突變體R270G、P275A、E183G和I324N的mRNA水平無(wú)明顯變化，F(xiàn)121L、A156P和R408Q的mRNA水平有明顯增加；
　　 （2） Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除突變體R408Q的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變外