甘藍(lán)型油菜苯丙氨酸解氨酶及其抑制因子的研究.pdf

1、本研究對甘藍(lán)型油菜PAL的分離純化、基本性質(zhì)及其抑制因子等進(jìn)行了研究和探索，主要研究結(jié)果如下： 1.通過比較篩選發(fā)現(xiàn)，0.1mol/L的硼酸緩沖液較適合甘藍(lán)型油菜PAL的提取，40℃的保溫溫度較適合其活性的檢測。通過對各個部位PAL活性的比較發(fā)現(xiàn)，開花后35d的甘藍(lán)型黑籽油菜莢果活性最高，是作為分離純化PAL的最佳材料。另外，通過用DEAEFF和QFF兩種離子交換柱來純化脫鹽后的PAL比較發(fā)現(xiàn)，QFF柱更適合用于甘藍(lán)型油菜PAL

2、的分離純化。 2.為了研究不同飽和度的硫酸銨溶液制備PAL的效果，對PAL粗提液進(jìn)行了分級鹽析，結(jié)果表明甘藍(lán)型油菜PAL主要集中在35﹪～60﹪飽和度的硫酸銨鹽析范圍內(nèi)沉淀出來。采用硫酸銨鹽析沉淀、透析袋脫鹽、HiPrep16/10QFF陰離子交換柱層析分離對甘藍(lán)型油菜PAL進(jìn)行分離純化，經(jīng)過三步純化后，得到了部分分離純化的PAL，蛋白質(zhì)得率為0.88﹪，酶的得率為5.1﹪，純化倍數(shù)為5.76。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得亞

3、基分子量約為46KD，推測其全酶分子量為184KD。 3.在對PAL進(jìn)行初步純化的基礎(chǔ)上，對其基本性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：甘藍(lán)型油菜PAL在Tris-HCl緩沖液中最適pH值為8.4，在硼酸緩沖液中最適pH值為：pH8.4、pH8.8。用pH4.0和pH10.0的緩沖液處理，均會使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活性降低。其溫度曲線呈一鐘罩形，符合酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線，最適反應(yīng)溫度是60℃。該酶具有較好的耐熱性：70℃處理10min其

4、殘存活性仍保持在50﹪。隨著底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度的逐漸增大，酶的活性也逐漸增大，在底物濃度為0.02mol/L時，酶活性達(dá)到最大值。用Hanes法進(jìn)行雙倒數(shù)作圖，計算得兩個Km值分別為：Km1=1.01×10-3mol/L，Km2=0.778×10-3mol/L。貯存實驗證明該酶最好在-20℃下用甘油貯存。 4.PAL-I的初步研究：開花后40d的甘藍(lán)型黃籽油菜莢果的PAL-I抑制活性最高，多次離心分段鹽析得出35﹪～60﹪硫酸

5、銨飽和度是較合適的鹽析范圍，甘藍(lán)型油菜PAL-I是一種熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 5.甘藍(lán)型油菜PAL能被巰基化學(xué)修飾劑NEM所抑制，且NEM的濃度與酶活性的倒數(shù)為一直線，由直線斜率的大小可以看出PAL對NEM的敏感性較強。PAL也能被末端產(chǎn)物對香豆酸和肉桂酸所抑制，最佳抑制濃度分別為0.048mmol/L、0.07mmol/L，且肉桂酸的抑制作用略強于對香豆酸。 6.AlCl3、FeSO4、MnSO4、CuSO4都不同程度地促