LncRNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及對細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:肺部惡性腫瘤是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康、生活和生命威害最大的惡性腫瘤之一。根據(jù)全國腫瘤登記中心2014年最新研究顯示，全國男性肺癌的發(fā)病率為(1/105)49.27，在所有惡性腫瘤中位居第一位;女性肺癌的發(fā)病率為21.66，在所有惡性腫瘤中位居第二(乳腺癌25.89)。在全國城市中肺癌的發(fā)病率和死亡率為20.48和27.05均位居第一位;與此同時(shí)，在全國農(nóng)村中肺癌的發(fā)病率和死亡率為18.50和22.42也均位居第一位。隨

2、著現(xiàn)在科技的進(jìn)步以及各為研究者的深入研究，雖然對于肺癌的認(rèn)識越來越深入，但是在肺癌的防治仍然是我們目前面臨的重大難題。好多肺癌患者在出現(xiàn)臨床癥狀的同時(shí)就醫(yī)，大多數(shù)已處于中晚期，因此研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找肺癌的分子生物學(xué)早期診斷指標(biāo)，探討肺癌的治療靶標(biāo)，不僅是在臨床具有重要的價(jià)值，更重要的是對于社會更有積極的意義。
　　肺部惡性腫瘤的從發(fā)生到發(fā)展是一個(gè)逐步積累的過程，一般是由于細(xì)胞生長過程中調(diào)控紊亂及生長方式的改變，從而引起細(xì)胞發(fā)

3、生癌前病變及基因改變。肺癌的發(fā)生是一個(gè)積累性的基因損傷，是一個(gè)多步驟、多基因參與的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、以及表觀調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的紊亂，造成細(xì)胞組織器官失去原有的性質(zhì)及作用對于人體造成損傷。LncRNA是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平，一般而言，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs廣泛參與了基因組調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用。雖然長鏈非編碼RNAh19的異常表達(dá)與其他腫瘤的

4、發(fā)生，包括肝癌、卵巢癌、前列腺癌、大腸癌、乳腺癌，有著密切的關(guān)系[1-7]，但在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)文獻(xiàn)尚不多見。因此，本研究旨在研究長鏈非編碼RNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的異常表達(dá)對肺癌高危因素的相關(guān)性及對癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響。
　　方法:(1)收集64例手術(shù)治療患者中，術(shù)前診斷為非小細(xì)胞肺癌并未接受放化療，術(shù)后病理確診為非小細(xì)胞肺癌的患者，切除的新鮮癌組織及對應(yīng)的癌旁組織;并將組織冰鹽水中清洗干凈并放入液氮中速凍2

5、4小時(shí)移至-80℃冰箱保存。(2)qRT-PCR檢測64例非小細(xì)胞肺癌中h19的表達(dá)情況:首先采用Trizol法提取癌組織及正常組織的總RNA;然后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量鑒定，確保RNA的完整性;再次設(shè)計(jì)lncRNA h19的反轉(zhuǎn)錄引物以及相應(yīng)的上、下游引物，并且根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;最后應(yīng)用qRT-PCR檢測長鏈非編碼RNA h19的表達(dá)情況。(3)根據(jù)各組的表達(dá)情況分析其與肺癌高危因素的相關(guān)性。(4)選取

6、肺癌細(xì)胞株A549進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(5)應(yīng)用TRIZE方法提取非編碼長鏈RNA;利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行對提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定;設(shè)計(jì)lncRNA h19的反轉(zhuǎn)錄引物以及相應(yīng)的上、下游引物，根據(jù)h19基因β-actin基因[8]使用引物設(shè)計(jì)軟件primerprimer5，分別參照GeneBank所刊登序列設(shè)計(jì)，以內(nèi)參基因β-actin基因作為對照;再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR來測定細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)h19的情況。(6)構(gòu)建過表達(dá)的質(zhì)粒載體:pC

7、DNA3.1-lncRNA h19;首先根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，鑒定成功后構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-lncRNA h19，構(gòu)建完成后使用雙酶切以及瓊脂糖凝膠電泳再次進(jìn)行確定目的基因的真實(shí)性。(7)G418篩選穩(wěn)定表達(dá)A549細(xì)胞系:首先確定抗生素G418篩選濃度，然后篩選出較穩(wěn)定并且過表達(dá)lncRNAh19的細(xì)胞株A549-pCDNA3.1-lncRNAh19，并使用real-time

8、PCR技術(shù)來檢測目的基因表達(dá)水平，以確定細(xì)胞株是否已經(jīng)建立成功。(8)對于過表達(dá)的A549-pCDNA3.1-lncRNAh19細(xì)胞株通過劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞的遷移能力，并設(shè)置陰性對照組（只轉(zhuǎn)染空載體），設(shè)置空白對照組（加入轉(zhuǎn)染試劑）。(9)對于過表達(dá)的A549-pCDNA3.1-lncRNAh19細(xì)胞株通過MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測細(xì)胞的增殖能力，并以轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組及僅加入轉(zhuǎn)染試劑的空白對照組作為對比。(10)對于過表達(dá)的A549-pC

9、DNA3.1-lncRNAh19細(xì)胞株通過transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測細(xì)胞的侵襲能力，并設(shè)置陰性對照組（只轉(zhuǎn)染空載體），設(shè)置空白對照組（加入轉(zhuǎn)染試劑）。
　　結(jié)果:(1)lncRNA h19在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.05)(2)lncRNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)而與年齡、性別、有無吸煙史及腫瘤類型無相關(guān)性。(3)過表達(dá)lncRNAh19導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

10、的遷移、侵襲、增殖能力增加。
　　結(jié)論:(1)lncRNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯高于正常肺組織，提示其與腫瘤的發(fā)生有很大的關(guān)系，并且可能發(fā)生促癌基因的作用。(2)lncRNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，與年齡、性別、有無吸煙史及腫瘤類型無相關(guān)性，提示lncRNA h19表達(dá)增高的腫瘤組織易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(3)過表達(dá)lncRNA h19導(dǎo)致細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖性增加，提示lncRNA h1