轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在人非小細胞肺癌中的表達及其對腫瘤生物學(xué)行為的影響.pdf

1、肺癌是目前世界上對人類健康威脅最大的腫瘤。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)研究成果在肺癌治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,近年來肺癌的綜合治療水平有了很大進步。但非常遺憾的是,肺癌患者的長期生存率仍然徘徊不前。肺癌尤其是非小細胞肺癌使用目前的治療手段難以根除,腫瘤易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),其術(shù)后生存率低、中位生存時間短,術(shù)后生活治療差。治療肺癌最大的困難在于對其發(fā)病機制的研究無重大進展,因此深入揭示肺癌尤其是非小細胞肺癌發(fā)生的分子病理學(xué)機制,闡明決定肺癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)鍵基因

2、及其作用機制具有重要的科學(xué)意義。
　　 細胞惡性增殖、凋亡失衡并發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤最重要的生物學(xué)特征,也是腫瘤形成和發(fā)展的重要機制,這些特征的出現(xiàn)涉及多個基因的改變,并接受復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(metastasis—associated gene,MTA)家族包括MTA1、MTA2、MTA3三個主要成員。最近的研究表明,MTA家族尤其是MTA1具有促進惡性增殖的作用,并在腫瘤血管生成以及侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮

3、演重要角色。MTA在人類多種常見腫瘤中存在高表達,提示MTA與多種人類腫瘤的形成和發(fā)展有密切關(guān)系。
　　 目前,國內(nèi)外有關(guān)MTA家族與肺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究的較少,MTA家族成員在肺癌腫瘤惡性增殖、抗凋亡以及血管生成中的作用尚不完全清楚。基于以上分析,本課題從以下四個方面進行研究:
　　 第一部分MTA家族成員mRNA在人非小細胞肺癌組織表達及意義。
　　 使用熒光定量PCR法檢測中國漢族人群中非小細胞肺癌原發(fā)灶、

4、正常肺組織及腫瘤細胞系中MTA家族基因mRNA表達狀況,分析MTA家族基因mRNA表達水平與人非小細胞肺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(包括:患者年齡、性別、病理分期、腫瘤分期和淋巴結(jié)分期、病理類型及分化程度)。結(jié)果顯示:雖然MTA1基因的mRNA在人肺癌組織和正常肺組織中均有表達,但是肺癌組織中表達量明顯高于正常肺組織中的表達量,MTA1基因的mRNA在腫瘤組織中高表達率與腫瘤分期和淋巴結(jié)分期相關(guān),與患者年齡、性別、組織類型和分化程度等臨床病

5、理學(xué)特征無關(guān).而且MTA1基因的mRNA在人肺癌A549和SK—MES—1細胞中的表達量較高。以上結(jié)果提示MTA1基因可能與肺癌的發(fā)生和進展有關(guān)。MTA2基因的mRNA在人肺癌組織和正常肺組織中均有表達,但是肺癌組織中表達量明顯高于正常肺組織中的表達量,MTA2基因的mRNA在腫瘤組織中高表達率與腫瘤分期和淋巴結(jié)分期相關(guān),與患者年齡、性別、組織類型和分化程度臨床病理學(xué)特征無關(guān)。
　　 以上結(jié)果提示MTA2基因可能與肺癌的發(fā)生和進

6、展有關(guān)。MTA3基因的mRNA在人肺癌組織中表達陽性率為60％,在正常肺組織中表達陽性率為40％,在人肺癌組織中和正常肺組織中表達陽性率有明顯差別。MTA3基因的mRNA在人肺癌組織中的表達與患者年齡、病理分期有關(guān)與患者性別、腫瘤組織類型和分化程度無關(guān)。結(jié)果提示:MTA1、MTA2和MTA3基因的mRNA在人非小細胞肺癌組織中表達上調(diào),與肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　 第二部分MTA1蛋白表達與人非小細胞肺癌臨床病理學(xué)特征、增

7、殖及血管形成的關(guān)系。
　　 使用免疫組織化學(xué)法檢測中國漢族人群中非小細胞肺癌原發(fā)灶、正常肺組織中MTA1蛋白表達狀況,分析MTA1蛋白表達水平與人非小細胞肺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(包括:患者年齡、性別、病理類型及分級、病理分期等)。進一步使用免疫組織化學(xué)法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及CD34在人非小細胞肺癌中的表達,評估MTA1蛋白表達人非小細胞肺癌增殖及血管形成的關(guān)系。結(jié)果顯示:MTA1蛋白在

8、正常肺組織中未見明顯表達。在人非小細胞肺癌組織中表達升高,而且其表達與腫瘤病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),與非小細胞肺癌的其它臨床病理學(xué)特征(患者年齡、性別、N分期、腫瘤病理組織學(xué)類型)無明顯關(guān)系。MTA1蛋白表達陽性的肺癌組織中PCNA表達明顯增高,增殖指數(shù)增高,說明TA1蛋白表達陽性肺癌細胞增殖活躍。MTA1蛋白表達陽性的病例肺癌組織中微血管密度明顯高于MTA1蛋白表達陰性的肺癌病例。進一步研究顯示,MTA1蛋白表達陽性的肺癌組織中VEG

9、F表達高于MTA1蛋白表達陰性的肺癌,相關(guān)檢驗證明兩者表達具有相關(guān)性,說明MTA1可能通過VEGF促進腫瘤血管生成。
　　 結(jié)果提示:MTA1參與肺癌的發(fā)生與進展,與腫瘤細胞惡性增殖有關(guān),可能是肺癌細胞惡性增殖的促進因素之一；MTA1蛋白可能與肺癌血管新生有關(guān),其可能是促進腫瘤微血管生成的因素之一,可能通過VEGF促進腫瘤血管生成。
　　 第三部分hMTA1-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定。
　　 針對MTA1

10、基因設(shè)計4對發(fā)夾式siRNA模板,并構(gòu)建到慢病毒真核表達載體中,形成重組載體；PCR擴增MTA1基因并與pEGFP—N1-3FLAG真核表達載體構(gòu)建MTA1基因的過表達載體。慢病毒重組載體與MTA1基因的過表達載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,利用RNAi來阻斷MTA1基因的表達以篩選有效靶基因序列。觀察慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率,使用Western blot檢測共轉(zhuǎn)染后MTA1基因蛋白表達的變化,MTA1基因蛋白表達下降最明顯的序列為最佳干擾序列。根

11、據(jù)篩選結(jié)果制備hMTA1-shRNA慢病毒載體,為下一步研究重組慢病毒載體的RNAi干擾效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
　　 第四部分hMTh1-siRNA慢病毒載體RNA干擾MTA1基因?qū)θ朔伟┘毎涤绊懙捏w外實驗研究。
　　 使用hMTA1-siRNA慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染人肺癌A549和sK-MES—1細胞,觀察轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染對MTA1基因表達的影響,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。進一步通過MTT法繪制生長曲線,觀察MTA1基因表達抑制對人肺

12、癌A549細胞系體外增殖能力的影響；并使用TRANSWELL Assay檢測人肺癌A549細胞系體外侵襲和轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　 結(jié)果顯示:研究中構(gòu)建的hMTA1-siRNA慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)染人肺癌A549和SK—MES-1細胞,人肺癌A549和SK—MES-1細胞轉(zhuǎn)染效率均大于80％。hMTA1-siRNA慢病毒載體對A549細胞和SK-MES—1細胞中MTA1基因有顯著的抑制效應(yīng),相對NC組,KD組MTA1基因抑制效率分別