基于高通量測(cè)序的離休人表皮干細(xì)胞熱損傷后microRNAs表達(dá)譜分析.pdf

1、目的：
　　探討離體人表皮干細(xì)胞熱損傷后的微小RNA（miRNA）的差異表達(dá)；并預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因及其參與的信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究創(chuàng)面愈合的機(jī)制及相關(guān)靶向治療提供新的線索。
　　方法：
　?。?）應(yīng)用胰酶消化法分離并培養(yǎng)離體人原代表皮干細(xì)胞。
　　（2）將細(xì)胞隨機(jī)分為2組，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞置于51.5℃水箱中孵育35s，對(duì)照組細(xì)胞置于37℃恒溫水箱中孵育35s，放置于倒置相差顯微鏡下，觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)及

2、生長(zhǎng)情況。37℃培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)6h后收集細(xì)胞樣本，用于提取總RNA。
　?。?）應(yīng)用TRIzol法提取兩組樣本細(xì)胞的總RNA，隨后采用RNeasy Mini Kit對(duì)RNA進(jìn)行純化及質(zhì)檢，以1ug Total RNA≥50ng small RNA起始量進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并用Agilent2200 TapeStation進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢；質(zhì)檢后文庫(kù)，按照HiSeq2500操作指南中要求制備上機(jī)樣本；使用Single Read Flow Ce

3、ll，按照HiSeq2500 User Guide的指示進(jìn)行HiSeq2500上機(jī)測(cè)序；得到測(cè)序結(jié)果；
　?。?）對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行miRNA家族分析及相關(guān)生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　?。?）倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)，表皮干細(xì)胞剛接種時(shí)貼壁牢固，形狀小而圓，折光性好。培養(yǎng)2d后，細(xì)胞克隆生長(zhǎng)較快，貼壁牢固，對(duì)照組37℃水浴后細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，細(xì)胞外形呈類圓形，貼壁牢固。實(shí)驗(yàn)組53.5℃水浴后細(xì)胞數(shù)量明顯

4、減少，細(xì)胞呈不規(guī)則外形，貼壁欠牢固；
　　（2）測(cè)序結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA共54個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的33個(gè)，表達(dá)下調(diào)的21個(gè)。其中上調(diào)最明顯的為hsa-miR-1973，下調(diào)最明顯的為hsa-miR-4520-5p。差異表達(dá)明顯上調(diào)的miRNA還有hsa-miR-4485-3p，hsa-miR-548j-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-4461；下調(diào)的miRNA有hsa-miR-4661-5p，h

5、sa-miR-191-3p，hsa-miR-129-5p，hsa-miR-147b，hsa-miR-6868-3p；
　?。?）通過(guò)對(duì)顯著差異表達(dá)的miRNA家族分析，探索其所屬的miRNA家族的分布情況，結(jié)果顯示差異miRNA家族為：mir-4520，mir-548，mir-132，mir-4510，mir-191，mir-129，mir-549，mir-154，mir-7641，mir-1976，mir-147，mir-651

6、1，mir-154，mir-744，mir-1287，mir-3064，mir-1295，mir-1248，mir-181，mir-193，mir-1294，mir-149，mir-515，mir-506，mir-338，mir-17，mir-486，mir-431，mir-4504，mir-29，mir-134，mir-221，mir-194，mir-6511；miRNAs靶基因預(yù)測(cè)及相關(guān)生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，差異表達(dá)的 miRNA