人α-乳白蛋白基因YAC作為HSA基因高效表達載體的研究.pdf

1、中國農業(yè)大學碩士學位論文人α-乳白蛋白基因YAC作為HSA基因高效表達載體的研究姓名：曾俊偉申請學位級別：碩士專業(yè)：生理學指導教師：陳永福;任立明20040601A b s t r a c tA m a j o r p r o b l e m i nt h ep r o d u c t i o no f t r a n s g e n i ca n i m a lm a m m a r y g l a n d b i o r e a c

2、 t o r si st h el o wp r o d u c t i o nr a t eo f h i g h - e x p r e s s i n g t r a n s g a n i ca n i m a l s d u e t ot h ep o s i t i o ne f f e c t ．T oo v e r c o m e t h a t ．i n c l u d i n ga l l r e g u l a t

3、 o r ye l e m e n t s i n t h ec o n s t r u c t so f e x p r e s s i o nv e c t o rs e e m st o b et h em o s tr e a s o n a b l ew a y ．b u tt h i si s v e r yd i f f i c u l tw h e n w e U S ep r o k a r y o t e - b a

4、 s e dc l o n i n gs y s t e m ．I th a v eb e e n r e p o r t e d t h a t t h e 2 1 0 k by e a s t a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ( Y A C ) i n c l u d i n gt h eh u m a n a- l a c t a l b u m i n g e n e c o u

5、l d d i r e c t t h e t r a n s g e n e t o e x p r e s s i n a p o s i t i o n —i n d e p e n d e n t m a n n e r ,t h e r e f o r e i s a l l e x c e l l e n te x p r e s s i o nV e c t o r t o p r o d u c et r a n s g

6、 e n i ea n i m a l b i o r e a e t o r s ．B u tt h er o u t i n em e t h e d so fY A C t r a n s g e n et r a n s f o rs u c ha s m i c r o i n j e c t i o nc a n n o ti n t r o d u c eY A C i n t ol i v e s t o c k sb

7、y n o w ．T h er a p i dd e v e l o p m e n to f 柚i m a lc l o n i n gt e c h n o l o g yp r o v i d ean e w w a y ：t h et a r g e t e d g o n eW a si n t r o d u c e d i n t ot h eY A C v e c t o rf i r s t ，t h e nt h e

8、r i g h tY A C - b e a t i n g y e a s tw a sf u s e di n t om a m m a l i a n c e l l s ，a tl a s tt r a o s g e n i ca n i m a l se x p r e s s i n g h i g h l e v e lt a r g e t e dp r o t e i nw a sp r o d u c e d u

9、s i n g c l o n i n g t e c h n o l o g y ．A c c o r d i n g t o a b o v ec o n s i d e r a t i o n ，e x p e r i m e n t s w a sc a r r i e d o u t a s b e l o w ：F i r s t ，t a r g e t e dg o n e - h u m a ns e r u ma l

10、 b u m i n ( H S A ) g e n ew a so b t a i n e dv i aP C R t e c h n o l o g y ．S e c o n d l y , t h eH S Ag o n e w a sl i g a n d e dw i t hap l a s m i dp R L A 2 2 w h o s e t w oa l m sc a r r yD N A s e q u e n c

11、e sn e c e s s a r yf o rc r o s s i n gw i t ht h eh u m a na - l a c t a l b u m i nY A C t of o r ma l li n t e g r a t i o nv e c t o rp R L A ·H S A ，t h e n t h ei n t e g r a t i o nv e c t o rp l a s m i dw

12、a s c o - t r a n s f o r m a t e di n t ot h er i g h tY A C 。o e a r i n g y e a s tw i t ha n o t h e rp l a s m i dp L R H 3 3w h i c hc a r r y sas e l e c t i v e g o n e ．F i n a l l y4r i g h tc l o n e sw a so b

13、 t a i n e df r o m8 6 4t r a n s f o r m a n t sb yP C R d e t e c t i o n ．S e q u e n c i n ga n a l y s i s s h o w e dt h a t t h eH S A g e n eh a v eb e e ni n t r o d u c e d i n t o t h er i g h t p o s i t i o

14、no f t h e h u m a n a —l a c t a l b u m i nY A C ．F u r t h e r m o r e ．w o r k st oo p t i m i z et h e c o n d i t i o n so fi n t r o d u c i n gt h er e c o m b i n a n tY A Ci n t og o a tf i b r o b l a s tv i a