微流控芯片Edman降解及在蛋白質(zhì)測序中的應用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),即蛋白質(zhì)內(nèi)氨基酸的排列順序是蛋白質(zhì)科學研究的前提,獲得該信息是一直是生命科學最重要研究內(nèi)容之一,具有相當重要的意義。然而當前蛋白質(zhì)序列測定的質(zhì)譜法和Edman降解法都存在著不足之處。前者的局限在于準確度不高,會產(chǎn)生錯誤、假陽性的結(jié)果：后者靈敏度過低,需要樣品量多,難于應用于同疾病相關(guān)的低豐度蛋白質(zhì)序列測定。本文首次研究在微流控芯片內(nèi)完成Edman降解,大幅度提高了Edman降解法測序的靈敏度,并且通過同MS技術(shù)聯(lián)用,提

2、高痕量蛋白質(zhì)序列鑒定的準確度。 笫一章綜述了蛋白質(zhì)一級序列測定進展。 第二章研制了體積僅為3.5 nL、可以重復使用的微流控芯片C18固相微萃取裝置,研究了在微流控芯片上精確控制納升級流體的方法。該C18柱可以富集痕量的多肽樣品。二維凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)酶解液通過固相微萃取脫鹽后,樣品體積由幾微升濃縮到50 nL并直接轉(zhuǎn)移至MALDI-TOF-MS靶上進行測定。分析結(jié)果表明新的方法能夠大幅度蛋白質(zhì)測定的序列覆蓋度。

3、 第三章研究了在微流控芯片用Edman降解測定蛋白質(zhì)序列的方法和性能,并通過分子量的差別鑒定多肽的序列。采用該方法測定了亞飛摩爾級別合成多肽的序列,比經(jīng)典的Edman降解法的樣品用量降低了數(shù)百倍。與MALDI-TOF-MS相結(jié)合測定二維凝膠電泳分離后銀染蛋白質(zhì)樣品序列時,原先模棱兩可的結(jié)果有了明確的歸屬。 第四章通過在微流控芯片上進行一個循環(huán)的Edman降解,準確地得到多肽N端氨基酸殘基的信息,解決了MS/MS譜圖內(nèi)難以辨別

4、b/y系列離子的難題,并成功地完成了三個多肽樣品(包括一個C端修飾的神經(jīng)多肽)的從頭測序。通過兩個循環(huán)的Edman降解能夠得到多肽的N端兩個氨基酸殘基的序列,根據(jù)這些信息能夠推斷出原始多肽MS/MS譜圖中b2離子的摩爾質(zhì)量。采用b2離子作為內(nèi)標,可以提高測定MS/MS譜圖中其它碎片質(zhì)荷比的準確度,從而解決了在MS/MS測定時難以用內(nèi)標法提高測定碎片離子摩爾質(zhì)量準確度的問題。 第五章旨在提高Edman測序的自動化程度。研究了用注射