定量檢測(cè)人血清IgG蛋白質(zhì)芯片的研制及應(yīng)用研究.pdf

1、研究?jī)?nèi)容分兩個(gè)部分，1．介質(zhì)表面修飾對(duì)蛋白質(zhì)芯片固定率和反應(yīng)性的影響。2．定量檢測(cè)人血清IgG蛋白質(zhì)芯片研制及應(yīng)用研究。 第一部分：對(duì)最常用的三種玻璃表面化學(xué)修飾方法對(duì)蛋白質(zhì)芯片質(zhì)量的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。為研制評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)固定效率的芯片，用Cy3標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體樣品，用含40％甘油的PBS溶液稀釋成為0.5mg/L，0.75mg/L，1mgmg/L，1.25mg/L，1.5mg/L，1.75mg/L，2.0mg/L等濃度。取戊

2、二醛、poly-L-lysine，GTPS環(huán)氧基修飾的玻片各一塊，按上述濃度點(diǎn)樣，每一濃度點(diǎn)1列3點(diǎn)，形成3×7的陣列，點(diǎn)樣過(guò)程的溫度為室溫(25℃)，濕度為30％～40％。點(diǎn)樣完成后，將玻片放入濕盒中進(jìn)行溫浴4h，晾干，用Genepix4000B掃描儀獲取熒光圖象。取出玻片，用PBST(PBS中含0.1％Tween-20)清洗3遍，每次5 min，再用PBS清洗5 min，晾干，再用Genepix4000B掃描儀獲取熒光圖象。為研制評(píng)

3、價(jià)蛋白質(zhì)反應(yīng)性的芯片，用倍比稀釋法，連續(xù)人血清1gG樣品分別至3.125mg/L，6.25mg/L，12.5mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L等濃度，在戊二醛、poly-L-lysine修飾的玻片點(diǎn)樣，每一濃度點(diǎn)1列3點(diǎn)，形成3×7的陣列，點(diǎn)樣過(guò)程的溫度為室溫(25℃)，濕度為30％～40％。點(diǎn)樣完成后，將玻片放入濕盒中進(jìn)行：37℃溫浴4h，晾干，用1％BSA(質(zhì)量體積比)作封閉，將玻片放入封閉液反應(yīng)1h，降低非特異性

4、吸附，用PBST(PBS中含0.1％Tween-20)清洗3遍，每次5min，再用PBS清洗5 min，將戊二醛修飾的破片用0.2％的硼氰化鈉還原Schiff堿形成更穩(wěn)定的單鍵結(jié)構(gòu)。取Cy3 goat-anti-human IgG(0.5 mg/L)1.6μl到芯片陣列的表面，用蓋玻片壓勻，放入濕盒中進(jìn)行37℃溫浴1h，取出用PBST(PBS中含0.1％Tweon-20)清洗3遍，每次5 min，再用PBS清洗5 min，晾干，掃描儀獲

5、取熒光圖象。三種修飾方法的芯片均可使蛋白質(zhì)保持較好的固定效率和反應(yīng)活性，由共價(jià)鍵偶聯(lián)的戊二醛修飾玻片不僅有更高的反應(yīng)活性，而且圖象佳，但背景略高。預(yù)點(diǎn)樣10個(gè)拷貝點(diǎn)后，各蛋白質(zhì)樣品的熒光測(cè)量值趨于穩(wěn)定，可正式點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后的固定時(shí)間以24-48h為宜。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)導(dǎo)致熒光測(cè)量值偏低。使用1％BSA封閉緩沖液的封閉效果最好。最佳的抗原一抗體特異性結(jié)合反應(yīng)溫度為37 0C、時(shí)間為2h，選擇1mg/ml作為最佳的點(diǎn)樣濃度。綜合評(píng)價(jià)，戊二醛

6、修飾的蛋白質(zhì)芯片優(yōu)于多聚賴氨酸修飾芯片，醛基修飾的蛋白質(zhì)芯片用于科研和臨床蛋白質(zhì)檢測(cè)是可行的，這為蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供選擇的依據(jù)但應(yīng)當(dāng)探討如何降低醛基修飾芯片的背景這對(duì)于提高蛋白質(zhì)芯片的敏感性和信噪比，具有重要意義，此方面技術(shù)有待進(jìn)一步探索。第二部分：建立定量檢測(cè)人血清IgG蛋白質(zhì)芯片的技術(shù)平臺(tái)。為研制定量檢測(cè)人血清IgG蛋白質(zhì)芯片，選擇醛基修飾的城片為載體，蛋白質(zhì)樣品溶解于20％甘油的PBS，由機(jī)械手將濃度為0.5mg/ml人Ig

7、G單克隆抗體點(diǎn)樣在玻片上，人血清白蛋白為陰性對(duì)照，以1％的BSA為封閉液對(duì)蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行封閉，并經(jīng)相應(yīng)處理，構(gòu)建用于定量檢測(cè)人血清lgG蛋白質(zhì)芯片。以IgG標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)對(duì)象，建立蛋白質(zhì)芯片方法和ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別用蛋白質(zhì)芯片方法和ELISA方法檢測(cè)10例人血清IgG。將純化的羊抗人IgG 0.5mg/ml 30％甘油/PBS，點(diǎn)樣在經(jīng)硝酸纖維素修飾的片基上，以人血清白蛋白為陰性對(duì)照，用1％BSA封閉，制備定量檢測(cè)人血清IgG

8、的蛋白質(zhì)芯片；同時(shí)用ELISA檢測(cè)人血清IgG。SPSS 10.0軟件分析蛋白質(zhì)芯片和ELISA的試驗(yàn)結(jié)果，采用單因素方差分析兩組間相關(guān)性。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)芯片和EIASA校準(zhǔn)曲線的R<'2>值分別是0.996和0.994。兩種方法檢測(cè)的10例人血清IgG含量，其檢測(cè)限均在1.56μg/100μL。用單因素方差分析結(jié)果顯示f=0.188，P=0.670>0.05，表明兩組間差異無(wú)顯著性意義，具有很好的一致性。本研究以人血清IgG為模型，比