表達(dá)霍亂毒素B與幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白的枯草芽孢抑制小鼠過敏性哮喘的研究.pdf

1、目的：
　　流行病學(xué)調(diào)查顯示，過敏性哮喘和幽門螺桿菌感染呈負(fù)相關(guān)性。本研究將可致耐受粘膜佐劑霍亂毒素B亞單位（CTB）與幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白（HP-NAP）融合表達(dá)于枯草芽孢表面。用表面表達(dá)CTB-NAP重組枯草芽孢口服免疫小鼠，并用卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)建立小鼠哮喘模型，評(píng)估口服枯草芽孢對(duì)哮喘小鼠的保護(hù)作用，為重組CTB-NAP枯草芽孢臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　CTB和NAP重組蛋白在大腸桿菌中

2、的表達(dá)、純化及抗血清的制備：丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)pET28a-CTB/BL21和pET28a-NAP/BL21融合蛋白的表達(dá)，使用鎳離子親和層析法純化的rCTB和rNAP蛋白。用純化的rCTB和rNAP重組蛋白皮下注射免疫大鼠，得到特異性抗血清。
　　CotC-CTB-NAP枯草芽孢載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增CTB基因，將CTB基因插入到pET28a-NAP質(zhì)粒NAP的上游，轉(zhuǎn)化E.coli BL

3、21。以pET28a-CTB-NAP質(zhì)粒為模板， PCR擴(kuò)增CTB-NAP基因，將其亞克隆入Pus186CotC質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600。挑取經(jīng)卡那霉素篩選的陽性菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切、PCR鑒定及測(cè)序分析。
　　芽孢的制備及重組芽孢Western Blot分析：用營(yíng)養(yǎng)耗竭法， DSM（ Difco Sporulation Medium）培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽孢產(chǎn)生，用特異性抗血清進(jìn)行Western Blot分析驗(yàn)證重組蛋白在芽孢

4、外殼的表達(dá)。
　　重組芽孢免疫小鼠及哮喘的激發(fā)：分別用CotC、CotC-CTB、CotC-CTB-NAP芽孢口服免疫小鼠，以Nave組和Asthma組作對(duì)照。腹腔注射致敏乳液致敏小鼠和1％OVA霧化激發(fā)。在最后一次霧化24-48 h內(nèi)采血、收集肺泡灌洗液（BALF）、提取脾細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行肺組織切片H&E染色，評(píng)估氣道炎癥情況。并在固定時(shí)間收集血清和糞便，用ELISA檢測(cè)血清中OVA特異性IgENAP和特異性IgG、IgG1

5、及IgG2a，糞便總IgA和OVA特異性IgA。ELISA檢測(cè)BALF和脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子水平，流氏細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　PCR擴(kuò)增出753 bp左右片段并將其成功克隆入Pus186CotC載體，測(cè)序結(jié)果顯示CTB-NAP在正確閱讀框中，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表面表達(dá)重組枯草芽孢質(zhì)粒（Pus186CotC-CTB-NAP）。重組芽孢S

6、DS-PAGE顯示在37.4 KDa處可見清晰的重組蛋白條帶，Western Blot顯示CotC-CTB-NAP在芽孢外殼蛋白中融合表達(dá)，重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　與非重組CotC組相比，口服重組CotC-CTB和CotC-CTB-NAP芽孢小鼠血清OVA特異性IgE(p＜0.001)顯著降低，和糞便IgA(P＜0.01)顯著升高。ELISA結(jié)果顯示CotC-CTB-NAP芽孢組血清中NAP特異性IgG、IgG1、IgG

7、2a顯著升高。BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)CotC-CTB（P＜0.01）和CotC-CTB-NAP（p＜0.001）芽孢能顯著降低BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比。BALF中細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CotC-CTB和CotC-CTB-NAP芽孢能降低IL-4（P＜0.05），升高IFN-γ（P＜0.05），和IL-10（p＜0.001）。脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)和BALF中一致，Th1型細(xì)胞因子升高和Th2型細(xì)胞因子降低。與非重組CotC組相

8、比，CotC-CTB、CotC-CTB-NAP芽孢能使脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg顯著升高（P＜0.05， p＜0.001），且CotC-CTB-NAP組比CotC-CTB更高（P＜0.01）。肺組織病理切片顯示口服CotC-CTB-NAP芽孢小鼠有少量的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)分泌物明顯減少，上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生不明顯，炎癥表現(xiàn)比其它組輕。
　　結(jié)論：
　　口服重組CotC-CTB、CotC-CTB-N