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文檔簡介
1、目的:探討瘦素對主動脈瓣膜間質(zhì)細胞(valvular interstitial cells,VlCs)表型轉(zhuǎn)化的影響,揭示瘦素在鈣化性主動脈瓣膜病(Calcific Aortic ValveDisease,CAVD)發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色。
方法:膠原酶消化法分離并培養(yǎng)豬主動脈瓣膜間質(zhì)細胞,取生長良好的P2-P4代細胞,采用含不同瘦素濃度的培養(yǎng)基(瘦素含量分別為Ong/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、2
2、00ng/ml、400ng/ml)分別刺激細胞24h,檢測細胞裂解液堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性,以確定最佳刺激濃度;用最佳刺激濃度的瘦素分別干預細胞24h、48h、72h,測出ALP活性以確定最佳干預時間。以最佳的刺激濃度刺激細胞達到最佳干預時間,提取細胞RNA以及蛋白,通過RT-PCR以及Western blot分別測定成肌標志物平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、成骨標志物骨橋蛋白(OPN)的表達情
3、況。
結(jié)果:瘦素刺激濃度在50ng/ml、l00ng/ml及200ng/ml時,ALP表達有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且瘦素濃度為100ng/ml時效果最為明顯;使用瘦素濃度為100ng/ml干預細胞24h后所測得ALP值最大,且具有統(tǒng)計學意義,因此確定100ng/ml為后續(xù)實驗的最佳刺激濃度,24h為最佳干預時間。RT-PCR結(jié)果實驗組與對照組相比較,OPN mRNA表達顯著增加(P<0.05),而α-SMA mRNA的表
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