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文檔簡介
1、目的:
在本實(shí)驗(yàn)室前期生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,本研究通過在體外誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素17的輔助性T(Interlukin-17 producing helper T,Th17)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T(regulatory T,Treg)細(xì)胞,探討腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)及白細(xì)胞介素6(Interlukin-6,IL-6)等通過調(diào)控miR-34a和miR-31的表達(dá),繼而mi
2、RNAs引起Treg細(xì)胞中叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Forkhead/winged helix transcription factor3,F(xiàn)oxp3)的表達(dá)水平的變化,使得表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞與表達(dá)維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(RAR-related orphan receptor gamma,RORγt)的Th17細(xì)胞間的比例失衡,進(jìn)一步導(dǎo)致以異常炎癥反應(yīng)為特征的自身免疫性疾病的發(fā)生。部分闡明在炎癥因子的作用下miRNAs導(dǎo)致T
3、reg/Th17細(xì)胞失衡的機(jī)制有助于更深入地揭示一些自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制,為自身免疫性疾病的治療提供理論依據(jù)。
方法:
在以往生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上,首先驗(yàn)證miR-34a、miR-31與Foxp3表達(dá)的相互關(guān)系。利用 DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)小鼠miR-31的慢病毒質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒(pLV-miR-31及MGP-31),將pLV-miR-31,MGP-31及本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pSMPUW-miR-34a與表達(dá)
4、小鼠 Foxp3基因的pCDNA-mFoxp3-3’-UTR(PFU)真核重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T(HEK-293T)細(xì)胞,通過實(shí)時定量PCR技術(shù)(Quantitative real-time PCR,qPCR)檢測Foxp3轉(zhuǎn)錄水平的變化,免疫印跡技術(shù)(Immunoblot)檢測Foxp3翻譯水平的變化。此外,采用轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)分別與小鼠外周CD4+T
5、細(xì)胞和小鼠T淋巴瘤細(xì)胞系EL4細(xì)胞共培養(yǎng)體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞和Foxp3+EL4細(xì)胞,分別檢測miR-34a及miR-31與Foxp3表達(dá)水平的相關(guān)性。接下來,為進(jìn)一步驗(yàn)證炎癥因子是否參與調(diào)控 miR-34a和miR-31,采用免疫磁珠純化CD4+CD62L+的初始 T細(xì)胞(Na?ve T cells)經(jīng)抗小鼠-CD3及抗小鼠-CD28單克隆抗體(anti-mouse CD3/CD28 mAb)活化,加入炎癥細(xì)胞因子組合體外誘導(dǎo)Th17
6、細(xì)胞,胞內(nèi)染色鑒定CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的百分比以評估 Th17細(xì)胞的純度,并采用qPCR測定miR-34a及 miR-31的表達(dá)水平。同時,利用 IL-6及 TNF-α這兩類Th17細(xì)胞相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子分別刺激小鼠CD4+T和EL4細(xì)胞,利用qPCR檢測炎癥因子作用下miR-34a及miR-31的表達(dá)水平,并通過Immunoblot檢測NF-κB磷酸化的水平及Foxp3的蛋白表達(dá)水平。最后,在IL-6和TNF-α等炎癥因子
7、模擬的微環(huán)境中以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)信號活化和抑制的調(diào)節(jié)下,利用qPCR檢測miR-34a及miR-31的表達(dá)水平,并通過流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,F(xiàn)CM)及Immunoblot技術(shù)檢測Foxp3的蛋白水平以分析其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
結(jié)果:
DNA測序結(jié)果表明,所構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pLV-miR-31及逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒M
8、GP-31中miR-31的前體序列正確;qPCR及Immunoblot結(jié)果表明miR-34a不抑制Foxp3的mRNA水平,但可抑制Foxp3的蛋白表達(dá)水平,而miR-31既可抑制 Foxp3的mRNA水平也可抑制 Foxp3的蛋白水平。在 TGF-β誘導(dǎo)的iTreg與Foxp3+EL4細(xì)胞中,miR-34a及miR-31表達(dá)水平下調(diào)同時Foxp3表達(dá)上調(diào),表明miR-34a及miR-31與Foxp3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。采用白細(xì)胞介素1
9、β(Interlukin-1 beta,IL-1β)、IL-6、白細(xì)胞介素-23(Interlukin-23,IL-23)、TGF-β、γ-干擾素中和抗體(Interferon-gamma neutralizing antibody,anti-IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4中和抗體(Interlukin-4 neutralizing antibody,anti-IL-4)等炎癥因子在體外與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)高純度的Th17細(xì)胞中,miR
10、-34a及miR-31在Th17細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高,提示某些炎癥細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)miR-34a及miR-31的轉(zhuǎn)錄活性。單獨(dú)采用IL-6或TNF-α與小鼠CD4+T細(xì)胞或EL4細(xì)胞共育時, IL-6和TNF-α均可上調(diào)miR-34a及miR-31的表達(dá),同時上調(diào)NF-κB磷酸化水平并抑制 Foxp3的翻譯。EL4細(xì)胞加入 NF-κB抑制劑(BAY11-7082)可下調(diào)miR-34a及miR-31,并逆轉(zhuǎn)了NF-κB對Foxp3的翻譯
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