糖尿病小鼠角膜的晝夜節(jié)律及創(chuàng)傷修復(fù).pdf

1、目的：研究表明晝夜節(jié)律與代謝性疾病密切相關(guān)。本研究旨在觀察鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠角膜時鐘基因、分裂細胞和炎癥細胞隨晝夜節(jié)律的變化，以及胰島素對糖尿病小鼠角膜節(jié)律的影響。并探索通過藥理性手段干預(yù)時鐘基因來促進糖尿病角膜創(chuàng)傷修復(fù)的可能性。
　　方法：
　　1.糖尿病小鼠模型
　　模型組小鼠空腹12h后一次性腹腔注射STZ(150mg/kg)，采用斷尾取血法，使用血糖儀檢測造模后的小鼠血糖，非禁食狀態(tài)血糖值

2、≥11.1mmol/L為造模成功。STZ給藥3d后，STZ小鼠早晚注射胰島素，連續(xù)注射11d。
　　2.免疫熒光染色
　　利用整鋪片技術(shù)，DAPI染色顯示角膜分裂細胞（細胞核成對存在），anti-Ly6g抗體染色顯示角膜緣血管網(wǎng)募集的嗜中性粒細胞，anti-GL3抗體染色顯示遷移到角膜的γδT細胞。
　　3.糖尿病小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)模型的建立
　　糖尿病造模成功后，糖尿病小鼠注射3mg/kg的SR8278。每天給藥

3、一次，注射7天。其他組小鼠注射等體積的含有相同濃度 DMSO的PBS。注射 SR8278第7天后，進行角膜創(chuàng)傷修復(fù)模型的建立。使用直徑為2 mm的環(huán)鉆標記角膜中央?yún)^(qū)域，高爾夫樣刀機械性刮傷角膜上皮細胞層。創(chuàng)傷后不同時間點使用2％的熒光素鈉染色分別顯示正常小鼠、糖尿病小鼠（STZ）、STZ+SR8278小鼠的創(chuàng)傷面積。
　　4.實時熒光定量PCR
　　使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測小鼠角膜組織中Clock、Bmal1、Per2

4、、Cry1、Rev-erb?和Sirt1基因的相對表達量。
　　結(jié)果：
　　1．胰島素部分恢復(fù)糖尿病小鼠角膜晝夜節(jié)律的改變
　?。?）糖尿病小鼠角膜組織的Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Rev-erb?基因表達的晝夜節(jié)律發(fā)生了改變，其中Clock、Bmal1和Per2的表達降低，而Cry1和Rev-erb?的表達增高。使用胰島素后，Cry1、Per2和 Rev-erb?基因晝夜節(jié)律部分恢復(fù)，而Clock和B

5、mal1的節(jié)律沒有恢復(fù)。
　?。?）糖尿病小鼠角膜上皮有絲分裂細胞的晝夜節(jié)律發(fā)生了改變，糖尿病小鼠組分裂細胞數(shù)目比正常組小鼠顯著性下降。胰島素部分恢復(fù)糖尿病小鼠角膜有絲分裂細胞的晝夜節(jié)律。
　　（3）糖尿病小鼠角膜緣血管網(wǎng)募集的嗜中性粒細胞和γδT細胞的晝夜節(jié)律發(fā)生了改變，且嗜中性粒細胞和γδT細胞數(shù)目比正常組顯著增高。胰島素部分恢復(fù)糖尿病小鼠嗜中性粒細胞和γδT細胞的晝夜節(jié)律。
　　2．Rev-erb?拮抗劑SR82

6、78加速糖尿病小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)
　?。?）熒光素鈉染色結(jié)果顯示，正常組小鼠角膜在創(chuàng)傷后24h完成再上皮化，STZ小鼠在創(chuàng)傷后42h完成再上皮化，STZ+SR8278小鼠在創(chuàng)傷后30h完成再上皮化。（2）角膜創(chuàng)傷后上皮分裂細胞的動力學(xué)變化結(jié)果顯示，正常組小鼠在創(chuàng)傷后30h達到峰值，而STZ小鼠在36h達到峰值，STZ+SR8278在24h達到峰值。
　?。?）角膜創(chuàng)傷后遷移到角膜中央的嗜中性粒細胞的動力學(xué)變化結(jié)果顯示，正常組小

7、鼠的嗜中性粒細胞在創(chuàng)傷后18h達到峰值，而STZ小鼠在12h即達到峰值，且維持到30h，STZ+SR8278小鼠角膜中央嗜中性粒細胞募集數(shù)目在創(chuàng)傷后18h達到峰值。
　?。?）小鼠角膜Bmal1基因與Sirt1基因的變化結(jié)果顯示，STZ組小鼠角膜的Bmal1基因與正常組小鼠相比顯著降低，注射SR8278后，STZ+SR8278組小鼠的Bmal1基因與 STZ組和 Normal組小鼠相比顯著升高。STZ組小鼠與正常組小鼠相比Sirt

8、1基因的表達顯著降低，STZ+SR8278組小鼠與正常組和STZ組相比均顯著增加。
　　（5）SR8278對糖尿病小鼠生理指標結(jié)果顯示，SR8278不能降低糖尿病小鼠的血糖；也沒有降低糖尿病小鼠的尿量；STZ小鼠活動度比正常組小鼠降低。STZ+SR8278小鼠的活動度比STZ小鼠增高，但仍低于正常組小鼠。
　　結(jié)論：糖尿病小鼠角膜分子水平（Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Rev-erbα）和細胞水平（上皮細胞有絲