PET-MR結(jié)合免疫熒光定位研究移植MSCs在犬退變椎間盤中的轉(zhuǎn)歸.pdf

1、椎間盤退變(IVDD)已經(jīng)成為了當(dāng)代人類的主要健康問題之一。盡管骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)性用于治療椎間盤退變，但是植入的MSCs具體轉(zhuǎn)歸尚不明確，治療效果也有爭議。在缺乏無創(chuàng)和連續(xù)實(shí)時(shí)的方法來研究在體MSCs存活時(shí)間和分化機(jī)制的情況下，MSCs治療IVDD的效果很難有所突破。為實(shí)現(xiàn)這一目的，本研究使用外科手術(shù)造模的方法來制作IVDD的動(dòng)物模型，在其椎間盤中植入聯(lián)合轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)和HSV1-sr39tk[單純皰疹

2、病毒Ⅰ型胸苷激酶（herpes simplex virus type1thymidine kinase）的突變型，較野生型HSV1-tk免疫原性更低，敏感性更高]并且標(biāo)記氧化磁納米鐵顆粒(MION)的MSCs;同時(shí)使用PET-MR連續(xù)示蹤與組織免疫熒光雙相定位相結(jié)合的方法，研究MSCs在椎間盤退變病灶中的存活與分化機(jī)制，為椎間盤退變的干細(xì)胞治療提供基礎(chǔ)科學(xué)支持。
　　本研究包含3個(gè)部分:第一部分:犬椎間盤退變動(dòng)物模型的建立;第二部

3、分:HSV1-sr39tk聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)染和MION共標(biāo)記MSCs;第三部分:共標(biāo)記MSCs植入退變椎間盤后的轉(zhuǎn)歸，MSCs轉(zhuǎn)歸與退變椎間盤修復(fù)機(jī)制的關(guān)聯(lián)。
　　研究目的:
　?。ㄒ唬?yàn)證通過外科手術(shù)的方法經(jīng)腹膜后入路切開纖維環(huán)和有限破壞髓核，能否建立穩(wěn)定的犬椎間盤退變動(dòng)物模型。
　?。ǘ╅_發(fā)和驗(yàn)證HSV1-sr39tk聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)染并以MION共標(biāo)記MSCs能否作為一種工具細(xì)胞系，用于PET-MR聯(lián)合分子影像示蹤和組

4、織免疫熒光定位雙相成像以開展MSCs存活和功能分化的研究。
　?。ㄈ┐_認(rèn)植入退變椎間盤的MSCs是否可被PET-MR一期連續(xù)活體成像所示蹤并判斷存活時(shí)間;MSCs植入轉(zhuǎn)歸與椎間盤退變修復(fù)的相關(guān)程度;植入MSCs分化為何種絀胞及其功能性。
　　研究方法:
　?。ㄒ唬﹨⒖既慕馄侍攸c(diǎn)，采用左外側(cè)腹膜后入路，暴露切開L2～L5的前外側(cè)纖維環(huán)，切開纖維環(huán)后使用咬合口徑為1mm的髓核鉗部分髓核[預(yù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確認(rèn)采用此類髓核鉗咬除

5、一次髓核的量大約為（13.7±3.5）mg，約為總體積的10％]，縫合纖維環(huán)后逐層關(guān)腹。所有27只動(dòng)物被隨機(jī)分為3組:(1)sr39tk組:椎間盤中移植HSV1-sr39tk轉(zhuǎn)染的MSCs;(2)MION組:MION標(biāo)記的MSCs植入椎間盤;(3)sr39tk+MION組:椎間盤中植入HSV1-sr39tk轉(zhuǎn)染和MION共標(biāo)記的MSCs。以上3組被定義為實(shí)驗(yàn)組，植入MSCs均標(biāo)記GFP。在每組動(dòng)物的L2～L3和L3～L4椎間盤中植入細(xì)胞

6、。每只動(dòng)物中L1～L2作為陽性對(duì)照，L4～L5作為陰性對(duì)照。術(shù)后以磁共振、大體和HE染色確認(rèn)椎間盤退變模型是否制作成功。
　?。ǘ?1)以密度梯度離心+差速貼壁法分離培養(yǎng)MSCs;(2)使用LIPOFECTAMINE2000試劑轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒進(jìn)入MSCs，進(jìn)行熒光鑒定;(3)在培養(yǎng)基中加入濃度為20mg/mL的MION，給予MION標(biāo)記，最后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色確認(rèn)和標(biāo)記效率測定。(4)HSV1-sr39tk的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染:選擇p

7、LVX-DsRed-Monomer-N1載體，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中HSV1-tk基因序列以及文獻(xiàn)報(bào)道的HSV-sr39tk突變位點(diǎn)，得到HSV-sr39tk基因序列全長。根據(jù)載體信息選擇酶切位點(diǎn)為上游XhoI、下游KpnI。合成含有酶切位點(diǎn)的目的基因序列，測序鑒定后予HSV1-sr39tk重組慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染MSCs。(5)確定HSV1-sr39tk和GFP轉(zhuǎn)染、MION共標(biāo)記后骨髓MSCs增殖能力、代謝能力和表型變化。
　?。ㄈ?/p>

8、）(1)在X線正側(cè)位確認(rèn)和動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，將MSCs(1×106/mL)隨機(jī)經(jīng)皮注射進(jìn)入L2～L4椎間盤。檢查時(shí)間點(diǎn)是細(xì)胞植入后第3天、第2周、第3周和第4周，每個(gè)檢查時(shí)間點(diǎn)在每組細(xì)胞選擇18個(gè)椎間盤數(shù)據(jù)以供統(tǒng)計(jì)分析。(2)所有動(dòng)物行磁共振檢測由MION產(chǎn)生的低信號(hào)，信號(hào)減低程度以水平面正常椎間盤區(qū)和該區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度之差與正常椎間盤信號(hào)強(qiáng)度的百分比表示。
　　研究結(jié)果:
　?。ㄒ唬┰谡麄€(gè)試驗(yàn)周期，所有動(dòng)物保持健康。造模手術(shù)后6

9、周，MR檢查顯示所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的L2～L5椎間盤均表現(xiàn)為髓核的不均質(zhì)化、組織丟失和邊界不清。Pfirrmann分級(jí)保持在4～5級(jí)(4.26±0.24)，呈現(xiàn)出經(jīng)典的椎間盤退變表現(xiàn)。大體標(biāo)本顯示髓核出現(xiàn)的空洞、破裂和不均質(zhì)化，纖維環(huán)失去完整性并后突，椎間隙高度丟失且不對(duì)稱。HE染色顯示髓核中脊索細(xì)胞減少，髓核裂隙形成，髓核纖維環(huán)分界不清，纖維環(huán)排列紊亂，提示手術(shù)造模成功。
　　（二）(1)原代骨髓單核細(xì)胞經(jīng)過密度梯度離心和差速貼壁法培

10、養(yǎng)后3周左右，可穩(wěn)定篩選出MSCs細(xì)胞集落并傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞免疫熒光檢測、普魯士藍(lán)染色、Western blot檢測和細(xì)胞內(nèi)ABC檢測等結(jié)果證實(shí)HSV1-sr39tk聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)染MSCs及MION標(biāo)記成功。(3)增殖能力和代謝能力測定發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染后的MSCs細(xì)胞增殖代謝能力增強(qiáng)，MSCs表面抗原未發(fā)生變化，仍表現(xiàn)為干細(xì)胞表型。
　?。ㄈ?1)椎間盤修復(fù)效果:MSCs植入后3周，sr39tk組、sr39tk+MION組和M

11、ION組的Pfirrmann分級(jí)分別從4.45、4.36和4.20降為2.37、2.33和2.09。3組均顯示有顯著的椎間盤修復(fù)過程，3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第4周與第3周的結(jié)果相比，所有實(shí)驗(yàn)組中的Pfirrmann分級(jí)沒有進(jìn)一步改善。(2)MION組中，L2～L4椎間盤中MION信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)對(duì)比度(％)和低信號(hào)區(qū)面積(mm2)在MSCs植入后3天時(shí)與2周時(shí)對(duì)比（225.34±35.62vs.251.98±31.43;85.37±1

12、0.54vs.78.56±11.31;5.29±1.35vs.4.76±1.02），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。截至細(xì)胞植入后3周，這3個(gè)參數(shù)未均發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。直到第4周時(shí)，這3個(gè)指標(biāo)與細(xì)胞植入后3周時(shí)相比，均發(fā)生了有統(tǒng)計(jì)意義的變化（751.43±52.67vs.243.76±21.43;47.37±5.01vs.77.79±9.98;1.78±0.31vs.4.67±1.14,P＜0.01)。在sr39tk+MION組中每個(gè)檢查時(shí)間點(diǎn)

13、上，MION信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)對(duì)比度(％)和低信號(hào)面積隨植入時(shí)間發(fā)生的改變均與MION組中的結(jié)果一致。
　　研究結(jié)論:
　　（一）通過外科手術(shù)，以有限破壞纖維環(huán)和摘除少量髓核的辦法，可以穩(wěn)定誘導(dǎo)出犬椎間盤退變模型，并且在磁共振和組織染色中得到證實(shí)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物損耗小，壞死過程基本符合椎間盤退變的病理生理表現(xiàn)，但是受制于人類直立行走的特點(diǎn)，這種動(dòng)物模型在生物力學(xué)上與人類特征還有差異。
　?。ǘ?1)針對(duì)骨髓MSCs為異質(zhì)

14、性群體并且容易被成纖維細(xì)胞和血系細(xì)胞污染的情況，密度梯度離心與多次差速貼壁分離相結(jié)合的方法能夠提高細(xì)胞純度并縮短培養(yǎng)時(shí)間。(2)順序轉(zhuǎn)染HSV1-sr39tk、GFP和標(biāo)記MION的骨髓MSCs能夠功能表達(dá)相應(yīng)目標(biāo)蛋白。轉(zhuǎn)染后MSCs增殖代謝能力增強(qiáng)，表型不變，為最終植入體內(nèi)的步驟打下了良好的基礎(chǔ)。
　　（三）(1)MSCs在植入本文的腰椎間盤退變模型后，能夠存活的時(shí)間不超過3周;納米氧化鐵顆粒標(biāo)記結(jié)合MR成像不能作為一個(gè)可靠的技

15、術(shù)來決定MSCs植入退變椎間盤后存活的確切時(shí)間。此外，在不超過3周的存活時(shí)間段內(nèi)，MSCs能夠促進(jìn)退變椎間盤的修復(fù)，存活時(shí)間與椎間盤修復(fù)效果確切相關(guān)，但修復(fù)作用有限。(2)免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞比例隨時(shí)間增長期限在3周以內(nèi)。在本研究中，這樣的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)植入MSCs在植入IVDD病灶后存活時(shí)間不超過3周。植入后髓核區(qū)域內(nèi)GFP陽性細(xì)胞與髓核細(xì)胞相關(guān)基質(zhì)成分Ⅱ型膠原、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素和髓核細(xì)胞表面標(biāo)志物缺氧誘導(dǎo)因子-1α、

16、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2均為陽性共染，提示MSCs受到髓核微環(huán)境的誘導(dǎo)，在體內(nèi)發(fā)生了趨向髓核細(xì)胞表型的分化，也改善了椎間盤內(nèi)基質(zhì)成分，是MSCs移植修復(fù)椎間盤退變的機(jī)制。
　　研究意義:
　　本研究的意義在于:為MSCs治療椎間盤退行性疾病提供基礎(chǔ)科學(xué)支持，在明確植入干細(xì)胞會(huì)發(fā)生何種轉(zhuǎn)歸的情況下，有助于提高植入干細(xì)胞的存活和靶向分化能力，改善植入微環(huán)境，最終目的是提高干細(xì)胞治療椎間盤退行性疾病的臨床效果。

17、>　　本研究的創(chuàng)新性:
　　(1)首次將HSV1-sr39tk聯(lián)合納米氧化鐵顆粒標(biāo)記MSCs，以構(gòu)建一種示蹤工具細(xì)胞。(2)首次使用一期PET-MR聯(lián)合的分子影像技術(shù)在體連續(xù)示蹤MSCs在椎間盤退變病灶中的轉(zhuǎn)歸。(3)在確認(rèn)MSCs植入后存活時(shí)間窗的基礎(chǔ)上，利用組織免疫熒光定位雙相成像技術(shù)，提示移植的MSCs在椎間盤退變病灶中分化為有功能的髓核樣細(xì)胞參與椎間盤退變的修復(fù);初步闡明MSCs修復(fù)椎間盤退變的機(jī)制，為今后進(jìn)一步改善修復(fù)效