免疫熒光技術

1、免疫熒光技術（Immunofluescencetechnique）又稱熒光抗體技術。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。免疫熒光技術包括熒光抗體技術和熒光抗原技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是

2、：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。(一)原理與方法原理與方法免疫學的基本反應是抗原抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。1.直接染色法將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經(jīng)一定

3、溫度和時間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽性標本對照，抑制試驗對照。2.間接染色法如果檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，作用一定時間后，洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標本反應

4、，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應，則抗體被固定或與熒光素標記的抗抗體結合，形成抗原抗體抗抗體復合物，再洗去未反應的標記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動物血清球蛋白免疫其

5、他動物來制備。間接染色法的優(yōu)點是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點是：由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應設陰、陽性標本對照，還應設有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。3.抗補體染色法抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser

6、等建立。本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗FITC含有異硫氰基，在堿性條件下能與IgG的自由氨基（主要是賴氨酸的ε氨基）結合，形成熒光抗體結合物。一個分子的IgG有86個賴氨酸殘基，但一般最多只能標記1520個。①直接標記法取抗體球蛋白溶液10ml，碳酸鹽緩沖液3ml，生理鹽水17ml，混合，在4℃電磁攪拌下加FITC3mg（先溶解在3ml緩沖液中），在4℃繼續(xù)攪拌46h，將結合物通過已平衡好的SephadexG25柱，以除去未

7、結合的游離熒光素。②透析標記法將抗體球蛋白溶液用碳酸鹽緩沖液（0.25molL，pH9.0調動1%(WV)，并裝入透析袋中，按蛋白質量的120稱取FITC溶于10倍抗體溶液量的碳酸鹽緩沖液中，將透析袋浸沒于FITC液中，于4℃攪拌1618h取出透析袋于0.01molL，pH7.2PBS中透析4h，將結合物通過已平衡好的SephadexG25柱，去除游離熒光素。(2)RB200標記本品為無定形褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質穩(wěn)

8、定，可長期保存，分子量為580，最大吸收光譜為570nm，呈明亮的橙色熒光，因與FITC的黃綠色有明顯區(qū)別，故被廣泛用于對比染色或用于兩種不同顏色的熒光抗體的雙重染色。方法為：取1gRB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳缽中研磨5min（在毒氣操作櫥中），加10ml無水丙酮，放置5min，隨時攪拌，過濾，用所得溶液進行結合。將每亳升血清用1ml生理鹽水及1ml碳酸鹽緩沖液（0.5molL，pH9.5）稀釋，逐滴加入0.1mlRB200

9、溶液，隨加隨攪拌，在04℃繼續(xù)攪拌1218h。(3)TMRITC標記TMRITC為紫紅色粉末，性能比較穩(wěn)定，分子量為443，最大吸收光譜為550nm，呈橙紅色熒光。其結合方法與FITC的直接標記法相同，只是所加色素量為蛋白質量的130140，結合時間持續(xù)1618h。（4）影響標記的主要因素溫度、時間、酸堿度和標記量4個因素。溫度低，標記時間長，溫度高，標記時間應短。FITC04℃以612h為宜，2025℃以12h為宜，37℃3045mi