ADMC的藥理活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)一系列香豆素類化合物免疫抑制、抗炎及降糖活性的篩選，找到一種活性較強(qiáng)的化合物即ADMC，并進(jìn)一步研究其免疫抑制及抗炎作用的機(jī)制，旨在找到其作用靶點(diǎn)及發(fā)揮免疫抑制與抗炎作用之間的關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種香豆素的其他藥理活性，對(duì)其進(jìn)行了抗癌活性篩選，為此化合物的新藥開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　方法：首先，利用T/B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)12種香豆素衍生物進(jìn)行免疫抑制活性研究，并根據(jù)不同藥物濃度對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖、L

2、PS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖的抑制率計(jì)算出各個(gè)化合物的IC50值；根據(jù)各個(gè)化合物對(duì)LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7分泌NO的抑制作用篩選其抗炎活性；以HepG2細(xì)胞的葡萄糖吸收為模型篩選各個(gè)化合物的對(duì)糖消耗的活性；將12種化合物的藥理活性進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)3-乙?；?6,7-二甲氧基香豆素（ADMC）藥理作用廣泛且藥效較強(qiáng)。其次，對(duì)ADMC的免疫抑制及抗炎作用進(jìn)行深入研究，以ConA刺激的T淋巴細(xì)胞、LPS刺激的B淋巴細(xì)胞、髓來(lái)源DC、

3、RAW264.7細(xì)胞、人單核細(xì)胞THP-1為研究對(duì)象，F(xiàn)ACS檢測(cè)其對(duì)T/B細(xì)胞周期及凋亡的影響，以及B細(xì)胞、DC細(xì)胞表型的影響；檢測(cè)其對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子分泌的影響，熒光定量 PCR及免疫印跡檢測(cè)其對(duì)相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響，顯微鏡下觀察THP-1細(xì)胞單核-巨噬的轉(zhuǎn)化過(guò)程，F(xiàn)ACS檢測(cè)細(xì)胞分群及平均熒光強(qiáng)度以佐證ADMC對(duì)單核-巨噬轉(zhuǎn)化的影響。同時(shí)，建立LPS/D-GalN誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎模型研究其體內(nèi)藥效，測(cè)定血

4、清ALT、AST及肝臟病理切片觀察其對(duì)肝功能的影響，檢測(cè)血清炎性因子的分泌及其對(duì)T、B細(xì)胞、DC及肝組織中CD8+T細(xì)胞這些免疫細(xì)胞的影響，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)肝臟組織中TLR4通路基因的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)肝組織中TLR4蛋白及脾組織中TLR4及JAK2-STAT3蛋白。再次，建立ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎模型驗(yàn)證其藥效，主要檢測(cè)其對(duì)肝功能及部分免疫細(xì)胞的影響。最后，采用MTT法檢測(cè)該化合物對(duì)Hela、HepG2、A

5、SPC-1、BXPC-3、MiaPaCa-2五種癌細(xì)胞系的抑制作用并利用SPSS19.0軟件計(jì)算IC50值，另外，以Hela細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)移植為研究模型，通過(guò)裸鼠生存曲線及體重曲線圖觀測(cè)藥物對(duì)裸鼠生長(zhǎng)、存活的影響，檢測(cè)ALT、AST肝功能指標(biāo)并觀察肝臟組織中腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，研究藥物對(duì)腫瘤肝轉(zhuǎn)移的藥理作用。
　　結(jié)果：首先，ADMC對(duì)T/B淋巴細(xì)胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，且對(duì)未增殖的脾淋巴細(xì)胞毒性較小，其發(fā)揮抑制作用的機(jī)理主要

6、是促進(jìn)了T/B淋巴細(xì)胞的凋亡；在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中，ADMC可明顯抑制NO，TNF-α的分泌，下調(diào)TLR4及其下游MyD88和TRIF的蛋白水平，同時(shí)抑制iNOS蛋白的表達(dá)；而在THP-1細(xì)胞單核-巨噬轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，ADMC并未發(fā)揮明顯藥效；同時(shí)，ADMC對(duì)HepG2細(xì)胞在有無(wú)胰島素情況下的糖攝取均有顯著的促進(jìn)作用。其次，ADMC在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎模型中發(fā)揮了顯著的預(yù)防保護(hù)作用。其能顯著降低ALT

7、、AST水平，明顯減少肝組織部位的炎性浸潤(rùn)，緩解肝組織損傷，對(duì)小鼠機(jī)體的免疫反應(yīng)具有顯著的抑制作用，其中明顯抑制T/B細(xì)胞的增殖，顯著減少血清中NO、TNF-α水平，對(duì)于主要發(fā)揮肝損傷作用的CD8+T細(xì)胞具有顯著的抑制作用。同時(shí)，對(duì)DC的遷移及成熟具有明顯的抑制作用，并促進(jìn)其免疫抑制作用的發(fā)揮。ADMC顯著下調(diào)肝臟及脾臟組織中TLR4蛋白的表達(dá)水平，并對(duì)脾臟中JAK2-STAT3蛋白表達(dá)水平及其活化具有明顯的抑制作用。再次，在ConA誘

8、導(dǎo)的自身免疫性急性肝損傷模型中驗(yàn)證了ADMC的藥效。最后，ADMC對(duì)幾種癌細(xì)胞系具有明顯的抑制作用，并能顯著抑制Hela細(xì)胞裸鼠體內(nèi)移植模型中腫瘤向肝臟的轉(zhuǎn)移，明顯減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，改善裸鼠的體重，提高其生存率，恢復(fù)其肝功能。
　　結(jié)論：ADMC具有廣泛的藥理活性，在體外發(fā)揮了顯著的免疫抑制、抗炎、降糖及抗腫瘤活性，其藥理活性的發(fā)揮可能與其誘導(dǎo)T/B淋巴細(xì)胞凋亡、降低TLR4與iNOS的蛋白表達(dá)水平、上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4的