萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)hemH和lba基因?qū)ζ洚a(chǎn)氫影響的初步研究.pdf

1、在無氧條件下，萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中的氫化酶(H2ase)能將光合作用過程中產(chǎn)生的H+和e-或細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物分解產(chǎn)生的H+和e-合成H2，釋放到細(xì)胞外。萊茵衣藻的氫化酶(H2ase)活性高，而且衣藻培養(yǎng)容易、遺傳學(xué)背景清晰、生長(zhǎng)速度快、實(shí)驗(yàn)操作容易，能利用太陽(yáng)能和水制氫，被認(rèn)為是目前非常有開發(fā)潛力的生物制氫的模式藻種。
　　 雖然衣藻的氫化酶(H2ase)活性高，但是衣藻的氫化酶(H2as

2、e)活性很容易受氧氣的抑制而失去活性，而氧氣又是光合作用的主要產(chǎn)物，這就導(dǎo)致了萊茵衣藻產(chǎn)氫效率低，限制了工業(yè)化產(chǎn)氫的發(fā)展。目前降低衣藻細(xì)胞內(nèi)氧氣含量的方法主要是通過去除培養(yǎng)基中硫元素來抑制光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)活性、進(jìn)而降低光解水產(chǎn)生的氧氣，但是該方法同時(shí)抑制了光解水所產(chǎn)生的電子產(chǎn)量，限制了產(chǎn)氫的電子來源，所以最終導(dǎo)致產(chǎn)氫效率低。因此，要提高衣藻的產(chǎn)氫效率就需要既降低細(xì)胞內(nèi)的氧濃度又要保障電子的供應(yīng)。
　　 大豆根瘤中的豆血紅蛋白

3、(leghemoglaobin，Lb)，它與氧氣有很高的親和能力，能幫助降低細(xì)胞內(nèi)氧濃度和調(diào)節(jié)呼吸作用，因而能使大豆根瘤中同樣對(duì)氧氣敏感的固氮酶具有高效固氮效率，生物發(fā)酵工程研究中已經(jīng)有應(yīng)用血紅蛋白體外表達(dá)而使產(chǎn)量提高的報(bào)導(dǎo)。豆血紅蛋白由兩部分組成，一部分是球蛋白(globin)，是由大豆(Glycine max)中的豆血紅蛋白(Lbs)基因合成；另一部分是血紅素，是由與大豆共生的慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japon

4、icum)合成。在根瘤菌中，hemH基因編碼合成的亞鐵螫合酶(Ferrochelatase)它催化血紅素合成的最后一步反應(yīng)，而血紅素的合成前體和代謝途徑與高等植物和衣藻中葉綠素的合成相同，由5-aminolevulinic acid(ALA)經(jīng)一系列反應(yīng)合成而來，所以衣藻中含有充足的血紅素合成的前體。
　　 本實(shí)驗(yàn)嘗試將慢生大豆根瘤菌中的亞鐵螯合酶hemH基因和大豆中的豆血紅球蛋白lba基因同時(shí)轉(zhuǎn)入衣藻藻種cc849的葉綠體中，

5、通過hemH基因表達(dá)亞鐵螯合酶(Ferrochelatase)催化合成血紅素，與球蛋白lba一起幫助降低葉綠體內(nèi)氧氣含量，增加產(chǎn)氫酶H2ase活性；同時(shí)結(jié)合部分恢復(fù)PSⅡ活性以增加電子供應(yīng)量，實(shí)現(xiàn)PSⅡ和氫酶同時(shí)最大限度行使其功能，為實(shí)現(xiàn)在常規(guī)條件下利用太陽(yáng)能持續(xù)生產(chǎn)氫能的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.提取慢生大豆根瘤菌的總DNA，從總DNA中克隆出了表達(dá)亞鐵螯合酶的基因hemH，與本

6、實(shí)驗(yàn)室前期克隆的球蛋白基因lba一起成功地構(gòu)建了衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化表達(dá)載體cg401-1-hemH-lba。
　　 2.通過基因槍法將載體cg401-1-hemH-lba轉(zhuǎn)入到萊茵衣藻葉綠體中，通過壯觀霉素篩選及液固反復(fù)繼代培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因藻株。
　　 3.通過PCR及RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba進(jìn)行DNA及RNA水平的檢測(cè)，PCR結(jié)果證實(shí)hemH和lba編碼區(qū)DNA已整合到部分衣藻葉綠體基因組中，

7、RT-PCR的結(jié)果表明hemH和lba基因在RNA水平上得到轉(zhuǎn)錄。
　　 4.通過Western Blot方法對(duì)轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，正常培養(yǎng)條件下hemH基因和lba基因的蛋白在衣藻葉綠體中都得到了表達(dá)，第六天(飽和期)表達(dá)量最大，在產(chǎn)氫培養(yǎng)第五天時(shí)蛋白量達(dá)到最大。
　　 5.對(duì)野生藻849和轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)表明：野生藻849飽和時(shí)的最大OD750值是3.5；轉(zhuǎn)基因衣

8、藻hemH-lba飽和時(shí)的最大OD750值是3，略低于野生藻849。飽和期時(shí)轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba的最大葉綠素含量為40mg/L左右，而野生藻849的最大葉綠素含量約為36mg/L左右，比轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba略低。結(jié)果表明，基因hemH-lba的轉(zhuǎn)入影響了萊茵衣藻的生長(zhǎng)速度，但是葉綠素含量沒有受到影響。
　　 6.利用紫外分光光度計(jì)掃描野生藻和轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba在500nm到600nm的OD值，在550nm處轉(zhuǎn)

9、基因衣藻hemH-lba有血紅素吸收峰，表明有微量血紅素合成。
　　 7.比較了野生藻849和轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba在不同含硫濃度0、12.5、25、50μM下的氫氣產(chǎn)量，氧氣含量和產(chǎn)氫速率。結(jié)果表明，在各個(gè)含硫濃度下轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba的氧氣量都是比野生藻849的氧氣量下降的快，產(chǎn)氫量比野生藻849有所提高。
　　 8.通過對(duì)轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba及其野生藻849進(jìn)行光照強(qiáng)度、葉綠素含量、含硫量三因素三水

10、平的正交實(shí)驗(yàn)，確定了以TAP為培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba及野塵藻849的最佳產(chǎn)氫條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)條件25℃下，轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba的最佳產(chǎn)氫條件為光照強(qiáng)度60μmol m-2 s-1，葉綠素含量0.5mg，含硫量12.5μmol/L；而野生藻849的最佳產(chǎn)氫條件為光照強(qiáng)度60μmol m-2s-1，葉綠素含量0.5mg，含硫量0mol/L。
　　 9.根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性修改了亞鐵螯合酶基因(hemH)的堿