萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是隸屬于綠藻門、團(tuán)藻目、衣藻屬的一種單細(xì)胞真核藻類，在缺氧脅迫的環(huán)境中，衣藻細(xì)胞內(nèi)的氫化酶催化質(zhì)子和電子生成氫氣，是生物制氫的模式物種。但目前實(shí)驗(yàn)條件下氫氣的產(chǎn)量無(wú)法達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)要求，因此從基因轉(zhuǎn)錄水平，闡述衣藻脅迫產(chǎn)氫的分子機(jī)理以及挖掘出與衣藻產(chǎn)氫相關(guān)的重要功能基因，可以為日后構(gòu)建高產(chǎn)氫的藻株提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　提取萊茵衣藻cc124（以下簡(jiǎn)稱為衣藻）不

2、同產(chǎn)氫時(shí)期和對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間的總RNA，利用Illumina HiSeq3000測(cè)序平臺(tái)開展RNA-Seq，并結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析衣藻產(chǎn)氫過程中各時(shí)期轉(zhuǎn)錄組間的基因表達(dá)差異。同時(shí)檢測(cè)衣藻產(chǎn)氫過程中淀粉、葡萄糖、甲酸、乙酸以及乙醇五種代謝物的含量，從代謝物的角度來(lái)分析衣藻產(chǎn)氫過程中碳水化合物的變化。得到的主要結(jié)果如下：
　?。?）繪制萊茵衣藻產(chǎn)氫速率圖，結(jié)果表明脅迫培養(yǎng)至96 h時(shí)產(chǎn)氫速率最高，144 h時(shí)氫氣產(chǎn)量達(dá)到最大為389

3、1.07μL/mg Chl?？蓪⒁略宓漠a(chǎn)氫過程分為3個(gè)階段：?jiǎn)?dòng)期（0 h-24 h），旺盛期（24 h-96 h）和衰退期（96 h-144 h）。
　?。?）總共構(gòu)建9個(gè)轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)（包括產(chǎn)氫啟動(dòng)期（0 h，24 h）、旺盛期（72 h，96 h）、衰退期（144 h）以及相應(yīng)對(duì)照組的時(shí)間點(diǎn)），每個(gè)文庫(kù)共獲得6G左右的2×100 bp的原始數(shù)據(jù)。其中0 h樣本獲得61,013,046條raw reads，脅迫產(chǎn)氫組4個(gè)樣

4、本共獲得251,403,358條raw reads，對(duì)照組4個(gè)樣本共獲得255,345,282條raw reads，表明各個(gè)樣本的測(cè)序產(chǎn)量均勻一致?；虮磉_(dá)量注釋結(jié)果表明9個(gè)樣本表達(dá)的所有基因的個(gè)數(shù)為14849個(gè)。
　?。?）通過對(duì)衣藻產(chǎn)氫過程中0 h-144 h間所表達(dá)的差異基因進(jìn)行聚類分析，可分為4個(gè)類群，再對(duì)每一類群基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明：脅迫產(chǎn)氫下調(diào)的cluster1差異表達(dá)基因的功能主要集中在光合作用、細(xì)胞內(nèi)

5、碳水化合物代謝、色素合成及代謝過程等；與產(chǎn)氫正相關(guān)的cluster3和cluster4差異表達(dá)基因主要功能是蛋白酶體、蛋白質(zhì)代謝過程、羧酸生物合成和代謝、淀粉生物合成、細(xì)胞內(nèi)氨基酸及衍生物合成與代謝過程、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、氫轉(zhuǎn)運(yùn)等；而cluster2中的基因無(wú)論在脅迫組還是在正常組中都表現(xiàn)為24 h下調(diào)表達(dá)，與衣藻產(chǎn)氫的關(guān)聯(lián)性不大。
　?。?）對(duì)產(chǎn)氫動(dòng)態(tài)變化過程中的差異表達(dá)基因進(jìn)一步采用Kobas軟件進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果表明：與硫代

6、謝相關(guān)的基因顯著上調(diào)，并一直持續(xù)到產(chǎn)氫旺盛期，直到衰退期時(shí)才下調(diào)表達(dá)，這與衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)是在缺硫培養(yǎng)的條件有直接關(guān)系；而光合作用、光合作用天線蛋白、糖酵解、TCA循環(huán)、丙酮酸代謝以及為衣藻細(xì)胞提供還原劑的磷酸戊糖途徑受到脅迫條件的強(qiáng)烈抑制，尤其在產(chǎn)氫旺盛期階段，基因顯著下調(diào)表達(dá)；另一方面，在產(chǎn)氫啟動(dòng)期衣藻大量合成一些氨基酸，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)修復(fù)，維護(hù)細(xì)胞膜；脂肪酸合成和代謝相關(guān)基因在產(chǎn)氫啟動(dòng)期下調(diào)表達(dá)，但在產(chǎn)氫中后期脂肪酸代謝、尤其是不飽和

7、脂肪酸合成通路的基因顯著上調(diào)表達(dá)。
　?。?）糖酵解通路相關(guān)基因在產(chǎn)氫初期表達(dá)上調(diào)，而在中后期下調(diào)表達(dá)，與衣藻產(chǎn)氫速率趨勢(shì)一致。經(jīng)初步篩選和挖掘，糖酵解通路中與衣藻產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：編碼HK、PYK、PFK、ADH的6條基因序列，其中HK、PYK、PFK為三個(gè)限速酶，ADH在產(chǎn)氫中后期與衣藻產(chǎn)氫的發(fā)酵代謝有關(guān)；與衣藻產(chǎn)氫負(fù)相關(guān)的基因主要有：編碼PYK、PDHB的4條基因序列。其中與產(chǎn)氫正相關(guān)的編碼PYK的為Cre03.g14

8、4847和Cre05.g234700兩條基因序列；與產(chǎn)氫負(fù)相關(guān)的編碼PYK的為Cre02.g147900和Cre12.g533550兩條基因序列。
　?。?）丙酮酸通路在產(chǎn)氫過程中受到強(qiáng)烈抑制，尤其是旺盛期。且丙酮酸是衣藻產(chǎn)氫過程中的最關(guān)鍵的中間產(chǎn)物。經(jīng)分析，丙酮酸通路中與衣藻產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：編碼PDHB和MDH的2條基因序列，這兩種酶可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)通路。與衣藻產(chǎn)氫負(fù)相關(guān)的基因主要有：編碼DLD、DLAT的2條基

9、因序列。
　　（7）三羧酸循環(huán)是衣藻細(xì)胞內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)和脂肪共同的一個(gè)通路。該通路中與衣藻產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：編碼CS、IDH、OGDH、LSC1和SDHC的6條基因序列，其中CS、IDH、OGDH為該通路中的限速酶。與衣藻產(chǎn)氫負(fù)相關(guān)的基因與丙酮酸通路中負(fù)相關(guān)的基因相同。
　?。?）衣藻產(chǎn)氫均是在弱光照或者黑暗的情況下進(jìn)行的，因此光合作用中大部分的轉(zhuǎn)錄本均下調(diào)，但編碼PetJ、ATFD2、LHCBM7和LHCA3的4條基

10、因上調(diào)表達(dá)，主要是調(diào)節(jié)PSII、PSI和細(xì)胞色素b6f復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)光合電子傳遞鏈。表明缺硫之后，光合作用并沒有經(jīng)歷一個(gè)簡(jiǎn)單的下調(diào)過程，而是一個(gè)更加復(fù)雜的過程。
　　（9）衣藻在缺硫培養(yǎng)基中產(chǎn)氫，硫代謝通路中與產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：產(chǎn)氫啟動(dòng)期內(nèi)，編碼sat、cysK、cysE、cysU、cysP的5條基因序列；產(chǎn)氫旺盛期內(nèi)，編碼sat和SIR的2條基因序列以及產(chǎn)氫衰退期編碼TST的1條基因序列。與產(chǎn)氫負(fù)相關(guān)的基因主要有：編碼c

11、ysQ、cysK和metB的3條基因序列。
　?。?0）萊茵衣藻cc124在脅迫產(chǎn)氫的過程中，代謝物的分析結(jié)果表明：產(chǎn)氫初期（0-72 h），衣藻體內(nèi)開始積累淀粉；產(chǎn)氫中后期（96 h-144 h），分解淀粉，淀粉減少；淀粉降解變?yōu)槠咸烟?，葡萄糖含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少；乙酸能夠使衣藻進(jìn)行呼吸作用，以便消耗掉體系中的氧氣，因此產(chǎn)氫過程中，乙酸含量有規(guī)律的減少；而甲酸和乙醇是衣藻脅迫產(chǎn)氫過程中發(fā)酵代謝的產(chǎn)物，因此體系達(dá)到厭