Rictor-mTORC2在急性與慢性腎損傷中作用及機制的研究.pdf

1、目的：
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種高度保守的非典型絲/蘇氨酸蛋白激酶，在生物體內可以調控細胞蛋白質的合成、細胞代謝、增殖、生長、自噬以及存活。mTOR作為核心蛋白參與組成mTORC1和mTORC2兩種復合體。許多研究表明mTORC1參與了多種腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，但是mTORC2信號通路在腎臟疾病中的作用尚不明確。已有研究表明mTORC2在多種細胞中參與了細胞的存活、轉分化以及能量代謝，而這些細胞學行為與多種腎臟

2、疾病密切相關。因此，我們想探討mTORC2信號通路在腎臟疾病包括急性腎損傷與慢性腎臟病中的作用與機制。
　　方法：
　　1.在mTORC2信號通路介導腎小管上皮細胞存活以及急性腎損傷的研究中，我們在大鼠近端小管細胞系NRK-52E細胞中在不同時間點加入順鉑，Westernblot檢測mTORC2信號通路。利用Rictor siRNA下調Rictor的表達，Western blot檢測Cleaved-caspase3，行TUN

3、EL染色以及抗Cleaved-caspase3抗體免疫熒光染色觀察Rictor/mTORC2在體外是否能夠影響順鉑誘導的小管細胞凋亡。在NRK-52E細胞中轉染GFP-LC3質粒，Scramble siRNA或Rictor siRNA，經順鉑處理后，觀察自噬小體的形成;利用Western blot檢測LC3活化水平。在NRK-52E細胞中轉染GFP-LC3質粒，加入二甲雙胍，觀察其是否能夠誘導自噬。通過Western blot檢測Cle

4、aved-caspase3，TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗體免疫熒光染色觀察二甲雙胍是否能夠對抗Rictor下調所導致的細胞損傷。體內實驗中，單次腹腔注射順鉑(20mg/kg)誘導小鼠急性腎損傷，1、2、3天后留取腎組織。利用Western blot以及免疫組化染色抗Rictor抗體觀察順鉑模型中Rictor在腎臟中的表達與分布。利用Cre-loxp系統(tǒng)構建腎小管上皮細胞Rictor基因特異性敲除小鼠模型（Tub

5、ule-Rictor-/-），出生2月后，與對照組小鼠相比較，觀察其一般情況是否有明顯異常;Western blot以及免疫熒光染色觀察Rictor是否被特異性敲除。分別以Tubule-Rictor-/-小鼠和Tubule-Rictor+/+小鼠為研究對象，單次腹腔注射順鉑(20mg/kg)誘導急性腎損傷，于注射后第1、2、3天采集腎組織標本以及血液標本。檢測血清尿素氮和肌酐水平觀察小鼠急性腎損傷后腎功能變化;利用PAS染色觀察腎臟組織

6、學變化并計算腎臟損傷分數。在順鉑處理后第3天的腎臟組織中，利用TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗體免疫組化染色觀察細胞凋亡;通過抗PCNA抗體以及抗Ki67抗體染色觀察兩組小鼠小管細胞的增殖;利用抗F4/80抗體以及抗Ly6b抗體免疫熒光染色觀察巨噬細胞和中性粒細胞聚集。在順鉑處理第2天的腎組織標本中，利用Westernblot以及免疫熒光染色觀察p-Akt(Ser473)在兩組小鼠腎組織的表達，利用Western

7、blot以及免疫熒光染色檢測LC3、電鏡檢測分析自噬小體，觀察小管細胞的自噬水平。
　　2.在mTORC2信號通路調控腎臟成纖維細胞活化以及腎間質纖維化的研究中，我們在大鼠腎臟成纖維細胞系NRK49F細胞中以不同時間點和劑量加入TGFβ1，利用Western blot以及免疫熒光染色檢測Rictor/mTORC2信號通路的變化。通過Rictor，Akt1，Akt2siRNA下調相應蛋白，與對照組相比較，觀察各蛋白對TGFβ1誘導N

8、RK49F細胞活化的影響。我們在CD1小鼠中，行單側輸尿管結扎(UUO)術作為腎間質纖維化模型，于術后7、14天留取腎臟組織。Westernblot以及免疫熒光染色觀察腎臟成纖維細胞Rictor/mTORC2信號通路的活化。構建成纖維細胞Rictor基因特異性敲除的小鼠模型(Fibro-Rictor-/-)，與對照組小鼠相比較，觀察出生2月后腎臟組織學以及一般情況有無明顯異常。以Fibro-Rictor-/-小鼠和Fibro-Ricto

9、r+/+小鼠為研究對象，行UUO手術，7、14天留取腎臟組織。利用Western blot以及免疫熒光染色觀察UUO模型中Akt的磷酸化;在腎組織中行PAS，Masson以及Sirus染色觀察腎間質纖維化;利用Western blot以及免疫熒光染色等方法觀察Fibronectin，α-SMA，typeⅠ collagen的表達;利用TUNEL染色觀察細胞凋亡;利用抗F4/80抗體免疫熒光染色觀察巨噬細胞在腎間質的聚集。
　　結果

10、：
　　(1)在NRK-52E細胞中，順鉑以時間依賴性的方式激活p-Akt(Ser473);利用Rictor siRNA轉染可以下調Rictor表達，而沉默Rictor可以加劇順鉑誘導的小管細胞凋亡。在NRK-52E細胞中，沉默Rictor可以抑制順鉑誘導的小管細胞自噬，二甲雙胍可以誘導細胞NRK-52E發(fā)生細胞自噬，并且能夠部分對抗Rictor下調所引起的細胞損傷。體內實驗部分我們發(fā)現腹腔注射順鉑后第2天的腎臟組織，Rictor

11、的蛋白水平略微上升，但是并沒有統(tǒng)計學差異;免疫組化的結果顯示Rictor主要在腎小管上皮細胞中表達。利用Cre-loxp系統(tǒng)構建腎小管上皮細胞Rictor基因特異性敲除的小鼠模型，在生理狀況下，Tubule-Rictor-/-小鼠在出生兩個月以后腎功能以及腎臟組織學并沒有異常改變。順鉑誘導急性腎損傷，Tubule-Rictor-/-小鼠與對照組相比，表現為更高的血清尿素氮、肌酐水平以及更嚴重的組織學損傷;Tubule-Rictor-/-

12、小鼠相比于對照組小鼠，無論是近端小管還是遠端小管，有更多小管細胞凋亡;兩組小鼠在順鉑誘導的急性腎損傷模型中，小管細胞的增殖并沒有顯著性差異;Tubule-Rictor-/-小鼠在順鉑誘導的急性腎損傷模型中，腎組織有更多中性粒細胞以及巨噬細胞聚集。在順鉑誘導的急性腎損傷模型中，對照組小鼠腎組織Akt(Ser473)的磷酸化水平以及細胞自噬都顯著升高;而Tubule-Rictor-/-小鼠的腎組織中，Akt(Ser473)的磷酸化以及細胞自

13、噬較對照組明顯減少。
　　(2) TGFβ1刺激NRK-49F細胞，能夠以時間以及劑量依賴性的方式激活Rictor/mTORC2信號通路。分別利用Rictor、Akt1、Akt2siRNA下調相應蛋白表達，可以抑制TGFβ1誘導的Rictor/mTORC2信號通路激活以及NRK-49F細胞的活化。在體內實驗部分，UUO術后7天以及14天的CD1小鼠腎組織中，Rictor/mTORC2信號通路在腎臟成纖維細胞中激活。利用Cre-lo

14、xp系統(tǒng)構建成纖維細胞Rictor基因特異性敲除的小鼠模型，在生理狀況下，出生2月后，腎功能以及腎臟組織學無明顯異常。行UUO手術兩周以后，Fibro-Rictor-/-小鼠的腎組織中，Akt的活化較對照組減少;腎間質纖維化以及細胞外基質的堆積較對照組明顯減輕。UUO兩周的腎組織中，Fibro-Rictor-/-小鼠腎組織中細胞的凋亡以及巨噬細胞的聚集較對照組明顯減少。
　　結論：
　　(1) Rictor/mTORC2信號