Hippo信號(hào)通路在調(diào)節(jié)卵巢生殖干細(xì)胞功能和延緩卵巢衰老中的作用.pdf

1、背景：如今，隨著老齡化社會(huì)的出現(xiàn)，衰老問題逐漸被人們所重視。在女性，卵巢衰老的速度要明顯快于機(jī)體其它器官。卵巢衰老影響生殖健康，引發(fā)絕經(jīng)期的到來、癌癥和多種慢性疾病的發(fā)生。然而，隨著生存環(huán)境的日益惡化、生活壓力不斷加大及藥物治療副作用等因素對女性卵巢功能的損害，使卵源性不孕癥及病理性卵巢功能衰退已成為困擾現(xiàn)代女性的重大社會(huì)衛(wèi)生問題。特別是隨著二胎政策的實(shí)施，高齡女性對于生活質(zhì)量以及生育壽命的需求日益強(qiáng)烈。故闡明卵巢功能的生理及病理性減退

2、機(jī)制、建立有效的干預(yù)手段，已成為醫(yī)學(xué)界刻不容緩的研究課題！近年來卵巢生殖干細(xì)胞（ovarian germline stem cells，OGSCs）的發(fā)現(xiàn)能為有效地增加原始卵泡池、改善卵巢功能、延緩卵巢衰老帶來前所未有的希望！
　　Hippo信號(hào)通路是調(diào)控成體干細(xì)胞增殖分化及功能的重要信號(hào)通路，我們前期研究發(fā)現(xiàn) Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)因子能觸發(fā)原始卵泡的啟動(dòng)。但 Hippo信號(hào)通路是否參與OGSCs功能的調(diào)控以及和生理性及病

3、理性卵巢功能衰老的關(guān)系還有待進(jìn)一步證實(shí)。因此本研究中，以 KM系小鼠及人卵巢皮層組織為實(shí)驗(yàn)對象：①分析Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)因子在卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium,OSE）細(xì)胞中的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化，這種變化與卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的關(guān)系；②離體觀察Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)因子YAP1在OGSCs增殖分化中的作用；③在體分析YAP1經(jīng)卵巢內(nèi)微注射對卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的拯救作用。

4、通過實(shí)驗(yàn)為深入探討成年哺乳動(dòng)物OGSCs的自我更新、分化及衰老等的生物學(xué)過程提供重要材料，為不孕癥的治療、重塑和保護(hù)卵巢功能提供技術(shù)方法和新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　第一部分、Hippo信號(hào)通路主要分子在生理性衰老和病理性衰老卵巢生殖上皮細(xì)胞中的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化
　　目的：分析Hippo信號(hào)通路的主要分子在卵巢生殖上皮（OSE）細(xì)胞中的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化，這種變化與卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的關(guān)系。
　　方法：選用7日齡（7

5、days,7D）、2月齡（2months,2M）、10月齡（10months,10M）和20月齡（20months,20M）小鼠卵巢，以及生育旺盛期（青春期后-35歲）、中年期（36-50歲）和絕經(jīng)期（51-60歲）人卵巢皮層樣本為生理性衰老卵巢實(shí)驗(yàn)標(biāo)本；通過雷公藤灌胃（Tripterygium Glycosides,TPT）及環(huán)磷酰胺/馬利蘭片（Cyclophosphamide/Busulfan,CY-BUS）腹腔注射方式，構(gòu)建病理性

6、衰老卵巢模型。分別經(jīng)HE染色，免疫化學(xué)方法及分子生物學(xué)方法等技術(shù)，比較Hippo信號(hào)通路的主要分子（LATS2，MST1與YAP1）在OSE細(xì)胞中的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化，以及這種變化與卵巢功能生理性衰老和病理性衰老的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　?。?）在不同年齡小鼠OSE中存在Hippo信號(hào)通路相關(guān)分子與OGSCs標(biāo)記因子（MVH與OCT4）共表達(dá)。其中，抑癌因子LATS2，MST1與MVH/OCT4的表達(dá)隨著年齡的增加而逐漸降低；原癌

7、因子YAP1則在2M小鼠OSE中表達(dá)量最高，7D齡其次，20M最低；pYAP1表達(dá)則為7D最高，且pYAP1/YAP1比值隨年齡增加而逐漸降低。
　　（2）在病理性卵巢衰老模型小鼠OSE中也存在Hippo信號(hào)通路相關(guān)分子與OGSCs標(biāo)記因子（MVH與OCT4）共表達(dá)。其中，YAP1，MST1與MVH/OCT4在雷公藤和環(huán)磷酰胺/馬利蘭片兩組藥物造成的衰老模型組中均表現(xiàn)為逐漸降低，而LATS2的表達(dá)則呈現(xiàn)出相反趨勢。pYAP1在兩組

8、病理性卵巢衰老小鼠卵巢中均顯著降低，而pYAP1/YAP1的比值則均顯著升高。
　?。?）在不同年齡階段人OSE中同樣存在Hippo信號(hào)通路相關(guān)分子與OGSCs標(biāo)記因子（MVH與OCT4）共表達(dá)。其中，MVH/OCT4隨著年齡的增長而逐漸下降，LATS2表達(dá)為青春期最高，YAP1和pYAP1為中年期最高，而MST1則為老年期最低；pYAP1/ YAP1則顯示出從青年期到老年期逐漸降低的趨勢。
　　結(jié)論：Hippo信號(hào)通路相關(guān)

9、分子LATS2，MST1與YAP1和OGSCs標(biāo)記因子MVH與OCT4共表達(dá)于小鼠和人OSE中，兩者表達(dá)的變化存在明顯的時(shí)序相關(guān)性，且這種變化與卵巢功能的生理性衰老和病理性衰老亦存在明顯的時(shí)序相關(guān)性。表明，Hippo信號(hào)通路可能通過調(diào)控OGSCs參與了卵巢功能的生理性衰老和病理性衰老過程。
　　第二部分、Hippo信號(hào)通路在卵巢生殖干細(xì)胞增殖和分化中的作用
　　目的：進(jìn)一步完善卵巢生殖干細(xì)胞（OGSCs）的分離、鑒定與培養(yǎng)方

10、法；探明Hippo信號(hào)通路對OGSCs增殖分化的影響。
　　方法：采用兩步酶分離方法及特異性抗體磁珠篩選技術(shù)（magnetic activated cell sorting，MASC）對OGSCs進(jìn)行分離，通過測定MVH，OCT4，Nango，F(xiàn)raglis，Stella等多種干細(xì)胞和生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記因子對OGSCs進(jìn)行鑒定，選用本室改良的方法對OGSCs進(jìn)行培養(yǎng)；將攜帶效應(yīng)因子YAP1的過表達(dá)和相應(yīng)shRNA的干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)

11、染至OGSCs，觀察對OGSCs增殖和分化的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）經(jīng)上述方法分離得到的細(xì)胞能共表達(dá)MVH，OCT4，Nango，F(xiàn)raglis，Stella等干細(xì)胞和生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記因子，故而初步鑒定所得細(xì)胞為OGSCs。
　　（2）LATS2，MST1及YAP1可在OGSCs上表達(dá)；OGSCs在轉(zhuǎn)染YAP1過表達(dá)慢病毒載體后，其特異性標(biāo)記因子MVH，OCT4的表達(dá)顯著升高，而在轉(zhuǎn)染YAP1shRNA的干擾慢

12、病毒載體后，MVH，OCT4的表達(dá)則顯著降低。
　　結(jié)論：已初步建立了OGSCs的分離、鑒定與培養(yǎng)方法；Hippo信號(hào)通路相關(guān)分子存在于OGSCs，并能調(diào)控OGSCs體外增殖。
　　第三部分、Hippo信號(hào)通路通過調(diào)控卵巢生殖干細(xì)胞的功能在卵巢功能重塑中的作用初探
　　目的：在體進(jìn)一步驗(yàn)證Hippo信號(hào)通路通過調(diào)控卵巢生殖干細(xì)胞（OGSCs）增殖和分化在卵巢功能重塑中的作用。
　　方法：選用Hippo信號(hào)通路中主

13、要效應(yīng)因子YAP1為靶基因，通過卵巢內(nèi)微注射將攜帶效應(yīng)因子YAP1的過表達(dá)和相應(yīng)shRNA的干擾慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染至不孕模型和生育旺盛期小鼠卵巢，觀察對卵巢生殖功能和內(nèi)分泌功能的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）不孕模型小鼠在轉(zhuǎn)染過表達(dá)YAP1后的30-75天期間，可以檢測到卵巢內(nèi)有卵泡再生，原始卵泡啟動(dòng)激活，子代出生率增加，同時(shí)伴有血清中E2和FSH水平上升，卵巢OSE細(xì)胞中YAP1與pYAP1表達(dá)和MVH與OCT4表達(dá)均明顯