T7肽通過下調(diào)Ang-2表達(dá)及聯(lián)合3-MA發(fā)揮其抗血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌在全球腫瘤發(fā)病率中居第六位，在惡性腫瘤致死率中居第二位，其中肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)約占肝癌總發(fā)病率的78％。HCC是一類富血管惡性實(shí)體腫瘤，起病隱匿、發(fā)展迅速、易于復(fù)發(fā)及侵襲轉(zhuǎn)移，而腫瘤內(nèi)的新生血管生成在HCC的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。目前，靶向干預(yù)腫瘤血管生成的藥物及其相關(guān)作用機(jī)制研究已成為關(guān)注熱點(diǎn)。索拉非尼是目前臨床上唯一用于治療晚期肝細(xì)

2、胞肝癌的分子靶向藥物，其具有明顯抗肝癌細(xì)胞增殖及抑制肝癌血管生成的作用，可提高晚期肝癌患者中位生存期約2-3月。然而，索拉非尼的耐藥性成為限制其臨床廣泛應(yīng)用的重要因素之一。因此，探索新型的血管生成抑制劑及其相關(guān)作用機(jī)制的研究可為索拉非尼的替代治療或聯(lián)合用藥方案的制定提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　腫瘤抑素(Tumstatin)是源于Ⅳ型膠原蛋白α3鏈的新型內(nèi)源性血管生成抑制劑，其主要通過降低哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶體(mammalian t

3、arget of rapamycin，mTOR)活性抑制內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及其增殖，發(fā)揮其抗血管生成作用。T7肽是全長Tumstatin內(nèi)的74-98氨基酸殘基序列，其具有與全長的Tumstatin相同的抗血管生成活性，且L、V、D氨基酸是T7肽發(fā)揮抗血管生成活性的主要氨基酸。但是T7肽具體調(diào)控機(jī)制尚不甚明確。因此，探索與T7肽抑制血管生成活性相關(guān)的信號(hào)通路及下游靶蛋白和靶基因可為未來T7肽

4、的臨床成藥的可能性及應(yīng)用提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　血管生成素(Angiopoietin，Ang)是除血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)外另一重要的促血管生成因子，其蛋白家族主要包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4，其中Ang-2主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞的韋伯潘力氏小體（Webel Paladebody，WPB）。在腫瘤缺氧微環(huán)境下，Ang-2可由WPB快速釋放，促

5、進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞間的解離，活化并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，同時(shí)可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的敏感性，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。而且在肝癌組織中Ang-2蛋白表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)明顯增加，并伴有肝細(xì)胞肝癌血管生成增加，可加速肝細(xì)胞肝癌的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。作為調(diào)控腫瘤血管生成的重要分子蛋白，Ang-2的具體作用機(jī)制及其在T7肽抑制血管生成過程中的作用具有重要研究意義。自噬(Autophagy)是細(xì)胞利用自身溶酶體降解胞內(nèi)損害的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過

6、程。自噬在血管生成中的作用已引起人們的重視，而某些血管生成抑制劑可誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬的增加，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡能力，進(jìn)而拮抗甚至逆轉(zhuǎn)血管生成抑制劑的抗血管生成活性，在一定程度上阻止了抗血管生成藥物的效果。因此，聯(lián)合自噬抑制劑如3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)以增強(qiáng)抗血管生成藥物的敏感性已進(jìn)入人們的研究視野。3-MA可靶向作用于Ⅲ型PI3K，抑制吞噬泡對(duì)胞內(nèi)成分的包裹，進(jìn)而達(dá)到其抑制自噬的目的。
　　靶

7、向干預(yù)肝細(xì)胞肝癌血管生成的分子藥物研究對(duì)于延長肝癌患者的生存期及改善遠(yuǎn)期預(yù)后至關(guān)重要。我們主要探尋Tumstatin中具有抗血管生成活性的T7肽片段調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路及下游可能的調(diào)控靶蛋白，以及促血管生成因子Ang-2在T7肽的抗血管生成活性中的作用，并進(jìn)一步研究T7肽與內(nèi)皮細(xì)胞自噬之間的相關(guān)性及其對(duì)血管生成的影響。
　　方法：
　　1.人肝癌細(xì)胞系HepG2裸鼠異位成瘤，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(n=15)，分別腹腔給予生理

8、鹽水和T7肽(4.4mg/Kg)，22天后裸鼠脫頸處死，獲取腫瘤標(biāo)本，蠟塊包埋切片，通過免疫組織化學(xué)方法，檢測腫瘤組織內(nèi)VE-鈣粘蛋白和CD31蛋白的表達(dá)，分析T7肽在體內(nèi)是否存在抑制血管生成作用。
　　2.我們選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein cells，HUVECs)作為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象，缺氧培養(yǎng)箱提供細(xì)胞培養(yǎng)缺氧環(huán)境(37℃，1％ O2，5％ CO2，94％ N2)，分別設(shè)置為常氧組、缺氧組、T7肽

9、（1.0μM）+缺氧組，體外小管形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析體外T7肽在缺氧環(huán)境下對(duì)于血管生成的影響。
　　3.為明確T7肽抑制血管生成的相關(guān)機(jī)制，在缺氧環(huán)境下HUVECs用不同濃度T7肽（0.25μM，0.5μM，1.0μM，2.0μM）處理24 h，CCK-8法觀察細(xì)胞活力變化，并選取T7肽（1.0μM）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在缺氧環(huán)境下T7肽分別處理HUVECs12 h和24 h，通過CCK-8法觀察細(xì)胞活力變化。
　　4.對(duì)數(shù)生長期H

10、UVECs分別設(shè)置為常氧組、缺氧組、缺氧+T7肽組，培養(yǎng)24 h后，AnnexinⅤ-FITC法檢測細(xì)胞凋亡情況。提取細(xì)胞總蛋白后，Western blot法檢測細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表達(dá)情況。
　　5.為明確Ang-2是否為T7肽的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，我們?cè)谏鲜鰧?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上加入缺氧+MK2206(5.0μM)組，MK2206為Akt特異性抑制劑，可作為缺氧+T7肽組的陽性對(duì)照組，培養(yǎng)HUVECs24 h，提取細(xì)

11、胞蛋白，通過Western blot法檢測相關(guān)蛋白Ang-2、Akt、p-Akt的表達(dá)情況。
　　6.在方法4實(shí)驗(yàn)分組的基礎(chǔ)上，我們加入缺氧+T7肽+rhAng-2(15 ng)組，分別通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法觀察內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力變化。
　　7.探索T7肽及Ang-2在肝癌細(xì)胞侵襲方面的作用，我們Transwell板上室接種HepG2細(xì)胞，下室接種HUVECs，下室HUVECs設(shè)置為常氧組、缺氧組、缺氧+T7肽

12、組、缺氧+T7肽+rhAng-2組，留取下室細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)Ang-2表達(dá)，Transwell法觀察HepG2細(xì)胞的侵襲能力變化。6孔板內(nèi)HUVECs設(shè)置為上述4組，留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心后用于培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，24 h后提取總蛋白，Western blot法檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)MMP2的表達(dá)情況。
　　8.為探索T7肽在細(xì)胞自噬方面的作用，我們首先在缺氧環(huán)境下用T7肽處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，丫啶橙染色觀察

13、自噬溶酶體形成情況。然后在相同條件下設(shè)置3-MA組、T7肽組、T7肽+3-MA（5.0 nM）組，再次丫啶橙染色觀察自噬溶酶體形成情況，Western blot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)情況。
　　9.為明確3-MA在T7肽抑制血管生成中的作用，HUVECs設(shè)置為缺氧組、缺氧+3-MA組、缺氧+T7肽組、缺氧+T7肽+3-MA組，通過小管形成實(shí)驗(yàn)觀察體外3-MA和T7肽對(duì)于血管生成影響，AnnexinⅤ-FITC法檢測內(nèi)皮

14、細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠異位腫瘤模型建立，腹腔分別給予生理鹽水和T7肽處理，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示T7肽明顯抑制腫瘤內(nèi)兩個(gè)重要血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-鈣粘蛋白和CD31蛋白的表達(dá)。體外小管形成實(shí)驗(yàn)也同時(shí)顯示缺氧情況下T7肽明顯逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的血管形成增加(P＜0.01)。
　　2.T7肽可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞活力，且具有濃度依賴性。T7肽濃度為0.5μM時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞活力高于1.0μM，但二者

15、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T7肽濃度為2.0μM時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞活力低于20％。選取T7肽濃度為1.0μM進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，CCK-8法檢測顯示T7肽處理24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯低于T7肽處理12小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞活力(P＜0.05)，且相同時(shí)間點(diǎn)T7肽可明顯抑制缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的活力。
　　3.AnnexinⅤ-FITC檢測顯示缺氧環(huán)境可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率。相反，T7肽可明顯增加缺氧下內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率(P＜0.01)。Western blot結(jié)

16、果顯示T7肽可以逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)于促凋亡蛋白Bax的下調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2的上調(diào)(P＜0.01)。
　　4.Western blot顯示缺氧可以誘導(dǎo)Ang-2蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，并同時(shí)增加Akt的磷酸化水平(P＜0.01)。但是，缺氧環(huán)境下T7肽可明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2蛋白的表達(dá)水平，抑制Akt的磷酸化(P＜0.01)。我們也發(fā)現(xiàn)Akt特異性抑制劑MK2206在抑制Akt磷酸化水平同時(shí)可明顯下調(diào)Ang-2的表達(dá)水平(P＜0.01

17、)，與T7肽具有相同的下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)蛋白。因此，T7肽可以通過下調(diào)Akt的磷酸化水平降低Ang-2的表達(dá)水平。
　　5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T7肽可以明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的增加(P＜0.05)。聯(lián)合應(yīng)用外源性rhAng-2，內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力較單獨(dú)使用T7肽處理時(shí)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。結(jié)果表明Ang-2蛋白可以增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　6.ELISA法檢測

18、發(fā)現(xiàn)，缺氧下胞外Ang-2蛋白水平明顯升高，T7肽可抑制上述過程(P＜0.01)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)含有高濃度Ang-2的HUVECs培養(yǎng)上清液可明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲(P＜0.05)及MMP2蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。T7肽可通過降低內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2的釋放間接調(diào)控肝癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　7.丫啶橙染色顯示T7肽可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬溶酶體增加，自噬抑制劑3-MA可逆轉(zhuǎn)此過程，Western blot顯示LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平可被T7肽

19、明顯提高(P＜0.01)。自噬抑制劑3-MA在缺氧環(huán)境下可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低體外血管生成(P＜0.01)。聯(lián)合自噬抑制劑3-MA，T7肽導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)使用T7肽時(shí)明顯增高(P＜0.01)，小管形成實(shí)驗(yàn)亦顯示聯(lián)合應(yīng)用3-MA和T7肽具有更強(qiáng)的抑制血管生成能力(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.缺氧環(huán)境下T7肽在體內(nèi)及體外均具有明顯抑制血管生成作用。
　　2.T7肽可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和抑制內(nèi)皮細(xì)胞活

20、力發(fā)揮其抗血管生成活性。
　　3.T7肽可通過靶向抑制Ang-2表達(dá)而降低內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力，進(jìn)而抑制血管生成。磷酸化的Akt水平降低在二者之間起“橋梁”作用。
　　4.T7肽可通過下調(diào)Ang-2表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Ang-2在腫瘤的侵襲中發(fā)揮重要作用。
　　5.自噬抑制劑3-MA可抑制血管生成，并能協(xié)同增加T7肽在降低血管生成和增加細(xì)胞凋亡中的作用。同時(shí)可推測T7肽誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬增強(qiáng)可在一定程度上拮抗T7肽

21、的抑血管生成作用。
　　意義：
　　1.發(fā)現(xiàn)了T7肽可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移及活力發(fā)揮其抗血管生成作用。
　　2.證實(shí)Ang-2可作為T7肽抗血管生成作用的調(diào)控靶點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)Akt通路的“橋梁”作用，為T7肽及Ang-2在腫瘤血管生成方面的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　3.揭示了T7肽可通過調(diào)控Ang-2表達(dá)發(fā)揮抗血管生成及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　4.自噬抑制劑可增強(qiáng)T7肽的抗血