Ang-1、Ang-2的表達(dá)與NPC淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系及PDT抗淋巴轉(zhuǎn)移作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的: 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinom，NPC）的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高傾向性及潛在的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重影響病人的預(yù)后。本研究首先明確淋巴管生成因子Ang-1、Ang-2（angiopoietin，Ang）在NPC中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，初步闡述其在腫瘤微淋巴管生成中的作用；然后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，利用光動(dòng)力學(xué)治療（Photodynamic therapy，PDT）處理NPC細(xì)胞包括CNE-2（高成瘤，低轉(zhuǎn)移）

2、和5-8F（高成瘤，高轉(zhuǎn)移）2個(gè)細(xì)胞亞株，以觀察對上述蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)探討PDT除高效殺瘤作用之外的其它抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為下一步進(jìn)行PDT抗淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。 研究方法: 1）利用D2-40單克隆抗體標(biāo)記NPC組織的微淋巴管，觀察記錄微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD），與臨床資料（性別、年齡、T分期、N分期及臨床分期等）進(jìn)行相關(guān)性分析。

3、 2）使用免疫組化技術(shù)檢測NPC組織的Ang-1、Ang-2表達(dá)水平，分別與臨床資料及LMVD進(jìn)行相關(guān)性分析，說明兩者在淋巴管生成中的作用。 3）以空白對照組、單加光敏劑組及單用激光照射組為對照，利用熒光檢測技術(shù)、CCK-8比色法摸索PDT對CNE-2和5-8F細(xì)胞亞株的半數(shù)致死劑量（LD50）。 4）使用平板克隆形成試驗(yàn)研究存活于PDT后的CNE-2和5-8F細(xì)胞亞株分別在形態(tài)學(xué)、增殖等方面的改變，并建立各自穩(wěn)定傳代的

4、細(xì)胞株備用。 5）研究存活于PDT后的CNE-2和5-8F細(xì)胞株在增殖、粘附（CCK-8比色法）和遷移（細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）等方面的改變。 6）使用免疫細(xì)胞化學(xué)及IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量處理，分別檢測存活于PDT后的CNE-2和5-8F細(xì)胞亞株中Ang-1、Ang-2的表達(dá)水平變化。 研究結(jié)果 1）D240成功地用于標(biāo)記組織中的微淋巴管；各組瘤周LMVD（pLMVD）均要高于瘤內(nèi)LMVD（iLMVD）

5、，差異有顯著性（所有P值均<0.05）；pLMVD或iLMVD在N分期中均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的LMVD均要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的LMVD（P分別<0.005和<0.01）。 2）Ang-1、Ang-2在NPC中的陽性表達(dá)率分別為46.15％和63.5％；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Ang-1、Ang-2表達(dá)水平均高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P<0.05），而與性別、年齡、T分期等因素?zé)o明顯相關(guān)性；Ang-1、Ang-2均呈陽性表達(dá)時(shí)發(fā)生

6、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率最高，單純Ang-2陽性次之，Ang-1陽性或兩者均為陰性時(shí)則無明顯差別。 3）Ang-1、Ang-2同時(shí)呈陽性表達(dá)時(shí)，pLMVD或iLMVD均明顯高于其它表達(dá)狀態(tài)（P<0.05），單獨(dú)Ang-1表達(dá)、單獨(dú)Ang-2表達(dá)及兩者都無表達(dá)組之間無明顯差異。 4）成功找到CNE-2和5-8F細(xì)胞亞株的PDT半數(shù)致死劑量（LD50），前者為0.25mmol/L_2h-1.44J/c㎡，后者為0.50mol/L-2h-

7、1.21 J/c㎡。 5）連續(xù)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)存活于PDT后的CNE-2和5-8F細(xì)胞亞株大多呈多邊形、細(xì)胞排列相對緊湊：進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在增殖能力有一定下降、粘附力改變不明顯、遷移能力明顯下降，上述改變以5-8F細(xì)胞亞株尤為明顯。 6）存活于PDT后的CNE-2和5-8F細(xì)胞亞株的Ang-1、Ang-2表達(dá)水平均明顯下降，以5-8F細(xì)胞亞株尤為明顯。 研究結(jié)論: 1）腫瘤微淋巴管可能是NPC發(fā)生