堿性成纖維生長因子對壓瘡肌細胞氧化應(yīng)激的作用及其機制探討.pdf

1、壓瘡深部組織損傷（Deep Tissue Injury，DTI）是壓瘡中最嚴重分期，好發(fā)于受壓骨隆突處，是臨床護理工作的重點和難點。DTI可有皮膚深部組織肌層損傷，局部持續(xù)受壓時，由于血流灌注受阻、大量自由基產(chǎn)生造成肌細胞損傷。其早期難以發(fā)現(xiàn)，發(fā)生潛匿，極易發(fā)展為難愈性創(chuàng)面。目前壓瘡機制研究主要集中于動物實驗，尚未有針對DTI機制的體外干預(yù)性研究。堿性成纖維生長因子（bFGF）對多種細胞損傷效果確切，是一種多能細胞生長因子。因此建立體外

2、DTI模型，在細胞水平對bFGF調(diào)控骨骼肌細胞氧化應(yīng)激機制及其相關(guān)蛋白表達進行探討，或許能夠深入理解壓瘡深部組織損傷，為其防治提供新策略。
　　第一部分：大鼠體外壓瘡深部組織損傷肌細胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建
　　目的：
　　構(gòu)建體外壓瘡深部組織肌細胞的氧化應(yīng)激模型，為在細胞水平進一步探討壓瘡深部組織的損傷機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大鼠成肌細胞，隨機分為6組即對照組及5個實驗組。對照組行

3、常規(guī)細胞培養(yǎng)，實驗組分別采用過氧化氫濃度50、100、150、200、250μmol/L處理1-4 h后檢測四氮甲基唑藍（MTT），重點觀察不同氧化應(yīng)激水平作用4h后乳酸脫氧酶（LDH）、肌細胞Hoechst染色及形態(tài)學(xué)方面的改變。
　　結(jié)果：
　　1.對照組1h至4 h細胞存活率為100％，活性無明顯變化。
　　2.實驗組過氧化氫在100μmol/L以下時，促進大鼠成肌細胞增殖，當濃度高于100μmol/L時，2 h

4、后呈損傷趨勢，4 h時存活率為20%-75%不等。
　　3.隨氧化應(yīng)激程度加重，大鼠成肌細胞形態(tài)逐漸縮收，細胞間隙逐漸增加。
　　4.100μmol/L過氧化氫作用4 h后，Hoechst細胞熒光染色顯示部分大鼠肌細胞趨向凋亡。
　　5.大鼠成肌細胞在100μmol/L過氧化氫作用4h后LDH釋放率相比對照組具有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.隨氧化應(yīng)激程度加重，大鼠成肌細胞活力下降，細胞膜通透性增加，胞

5、核漸進性凋亡。
　　2.大鼠成肌細胞經(jīng)過氧化氫100μmo l/L作用4 h，可作為壓瘡深部組織細胞氧化應(yīng)激的體外模型。
　　第二部分：bFGF干預(yù)在大鼠體外壓瘡深部組織的肌細胞損傷中的作用
　　目的：
　　在大鼠體外DTI氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，探討bFGF干預(yù)在大鼠成肌細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。
　　方法：
　　進行常規(guī)細胞培養(yǎng)，待細胞生長至指數(shù)增長期后，同時換液。根據(jù)培養(yǎng)基中有無H2O2及bFGF干

6、預(yù)可分為：正常對照組（Con），單純bFGF組（bFGF），氧化應(yīng)激組(H2O2)及干預(yù)組(bFGF+H2O2)。氧化應(yīng)激組過氧化氫濃度及時間點的確定參照R．Dhanya及前期體外DTI細胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建過程[43，51]的研究方法，干預(yù)組(bFGF+H2O2，bFGF濃度參考Wang等[52,53]的研究)，正常對照組不做任何處理。單純bFGF組：提前2 h給予100 ng/ml bFGF。氧化應(yīng)激組：100μmol/L雙氧水培養(yǎng)基

7、處理4 h。干預(yù)組：100 ng/ml bFGF預(yù)給2 h后，按照100μmol/L加入雙氧水繼續(xù)孵育4h。各組分別于實驗終點進行多水平檢測。免疫熒光法分析肌細胞的活性氧自由基、Bax及Cyt C表達情況；SABC免疫組化法于倒置顯微鏡下觀察Bcl-2與Bax表達變化；蛋白印跡檢測肌細胞PARP,PCNA等蛋白表達趨勢。
　　結(jié)果：
　　1.氧自由基表達水平：活性氧自由基檢測結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組中大鼠成肌細胞ROS熒光表達呈強

8、陽性，細胞突觸變短，胞質(zhì)明顯回縮。干預(yù)組相較于氧化應(yīng)激組，其氧化應(yīng)激強度顯著下降(P＜0.01)。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示：正常對照組和單純bFGF組大鼠成肌細胞的細胞質(zhì)中含有大量Bcl-2顆粒，少數(shù)細胞Bax顆粒少量表達；應(yīng)激組Bcl-2陽性顆粒明顯減少，Bax表達顯著增加；造模前2h給予bFGF干預(yù)，可上調(diào)Bcl-2水平，抑制Bax表達。
　　3.間接免疫熒光結(jié)果顯示：正常對照組和單純bFGF組的Bax及Cyt C蛋白

9、熒光較弱。氧化應(yīng)激組Bax熒光表達呈強陽性，Cyt C滲入胞外，呈彌漫性紅色熒光顆粒。而含有bFGF的干預(yù)組Bax熒光強度明顯減弱，Cyt C仍局限于胞質(zhì)，熒光顆粒亮度減弱。
　　4.Western blot檢測顯示：正常對照組和單純bFGF組低水平表達Bax蛋白、Cyt.C及PARP蛋白，PCNA較高水平表達；氧化應(yīng)激組Bax、Cyt.C及PARP蛋白表量明顯增加，細胞增殖分裂進程受阻；干預(yù)組大鼠成肌細胞Bax蛋白、細胞Cyt.