大豆C2H2型鋅指蛋白轉錄因子基因的克隆與鑒定.pdf

1、鋅指蛋白是一類廣泛存在于原核和真核生物體中的重要轉錄調控因子,在動植物的生長發(fā)育過程中均起著重要作用.C2H2(cys2/His2)型鋅指蛋白又稱為TFⅢA類鋅指或經(jīng)典鋅指,是鋅指蛋白家族中最大的一個亞族,也是真核生物轉錄因子中研究最多的一種與DNA或蛋白質結合的模式結構.目前報道的植物C2H2型鋅指蛋白主要參與植物各個時期的生長發(fā)育,以及脅迫應答的調控過程. 本研究通過分析GenBank大豆EST數(shù)據(jù)庫中已知的兩段保守序列,發(fā)

2、現(xiàn)它們的3'和5'端拼接后其重疊部分具有100﹪同源性,表明它們是同一個基因序列的兩個片段,該序列與已發(fā)現(xiàn)的大量的植物中的C2H2型鋅指蛋白保守基序具有很高的同源性.根據(jù)該序列設計特異性引物,進行RT-PCR,獲得了一個包含兩段序列的cDNA開放閱讀框序列,其核苷酸長度分別為516 bp,命名為GmC2H2.GmC2H2編碼一個具有172個氨基酸的蛋白,分子量約19 KD.含有兩個由21個氨基酸組成的C2H2保守基序,每個保守基序都具有

3、植物C2H2型鋅指蛋白特有的QALGGH序列,是一個典型的C2H2型鋅指蛋白.同時,GmC2H2含有L-Box和DLN-Box等結構序列. RT-PCR半定量分析表明:GmC2H2的表達受冷、ABA的誘導.GmC2H2能夠在大腸桿菌中以GST融合蛋白的形式表達,純化融合蛋白GST::GmC2H2,進行凝膠阻滯實驗,結果表明:GmC2H2鋅指蛋白在體外能與核心序列EPlS(TGACAGTGTCA)有很強的結合活性,GmC2H2與反

4、向重復中的一半位點中引入兩個堿基突變的突變探針結合活性有所下降,GmC2H2與反向重復中的兩半位點中都引入兩個堿基突變的突變探針幾乎沒有結合活性.說明GmC2H2鋅指蛋白與核心序列EPlS特異性結合.通過設計特異性引物PCR擴增及酶切、連接等方法獲得了:1個缺失第一個保守域及與第一個保守域C端順次銜接的7個氨基酸的突變體(命名為MZF1)、1個缺失第二個保守域及與第二個保守域N端順次銜接的19個氨基酸的突變體(命名為MZF2)和3個分別

5、缺失7個、19個和26個氨基酸的不同程度地縮短兩個保守域之間的距離的GST::GmC2H2融和蛋白突變體(分別順次命名為MZF4、MZF8和MZF10).突變體凝膠阻滯實驗結果表明:MZF1和MZF2與核心序列不結合,氨基酸缺失最少的MZF4與核心序列結合活性比GmC2H2顯著降低,MZF8和MZF10則幾乎不結合.說明GmC2H2鋅指蛋白的第一個保守域及與第一個保守域C端順次銜接的7個氨基酸、GmC2H2蛋白第二個保守域及與第二個保守

6、域N端銜接的19個氨基酸對其與核心序列EPlS的結合都是必需的,而兩個保守域之間的氨基酸序列組成則是影響GmC2H2鋅指蛋白與核心序列EPlS的結合的重要因素.通過將構建的GmC2H2基因的雙子葉植物轉基因表達載體GmC2H2::pCAMBIA和空pCAMBIA載體,借助于農桿菌侵染法,轉入模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn),同期轉基因型擬南芥的根長明顯小于對照,但是側根數(shù)目似乎比轉入空pCAMBIA載體的擬南芥的多,說明該基因可能參與根的發(fā)育.氨基