人鋅指蛋白基因ZNFD的克隆及其研究.pdf

1、鋅指蛋白是指含有鋅指結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)，在哺乳動物中，鋅指蛋白是最大的家族。本實驗室獲得一個人類新基因ZNFD(基因號為NM_182761)，該鋅指蛋白基因尚未被研究。對ZNFD基因進(jìn)行SMART分析，ZNFD主要的特征是含有一個C2H2結(jié)構(gòu)域，在其氨基酸228-248的位置存在一鋅指結(jié)構(gòu)，本實驗室便對這個新基因展開了以下幾個方面的初步研究。 首先，通過PCR的方法克隆新基因ZNFD，經(jīng)測序鑒定已成功克隆ZNFD基因，證實了其在人

2、體內(nèi)真實存在。利用生物信息學(xué)方法對其核酸和蛋白質(zhì)的特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ZNFD基因位于第5號染色體，定位在5q23.1。其cDNA全長1432bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，含有990bp的開放閱讀框，編碼一個由329個氨基酸組成，分子量為37KD的蛋白。通過PCR方法檢測ZNFD基因在人多個組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明ZNFD基因在前列腺、睪丸、腦、胰、子宮中表達(dá)，且睪丸中表達(dá)量比較高。通過構(gòu)建pEGFP-ZNFD真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)

3、染如COS-7細(xì)胞系，瞬時表達(dá)后用熒光顯微鏡觀察ZNFD融合蛋白亞細(xì)胞定位，證明ZNFD基因在細(xì)胞核中表達(dá)。 其次，兔抗人ZNFD多克隆抗體的制備。通過DNAstar軟件選取抗原免疫原性較高的部分ORF序列，常規(guī)PCR擴增后，定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a上，利用大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)His-ZNFD融合蛋白，得到相對分子質(zhì)量約為45kDa的融合蛋白。通過Ni離子親和柱純化目的蛋白免疫新西蘭

4、大白兔，獲得了兔抗人ZNFD多克隆抗血清。通過瓊脂糖雙向擴散實驗檢測所制備的多克隆抗體效價達(dá)到了1:32，且Western Blot免疫印跡方法鑒定抗體具有高特異性。 最后，構(gòu)建真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在ZNFD原核表達(dá)并制備多克隆抗體的基礎(chǔ)上，進(jìn)行ZNFD基因真核系統(tǒng)表達(dá)的研究。常規(guī)PCR擴增ZNFD基因全長后定向克隆到真核表達(dá)載體peDNA3-TAP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3-TAP-ZNFD，利用轉(zhuǎn)染試劑盒瞬時轉(zhuǎn)

5、染293T細(xì)胞，通過Western blot免疫印跡方法確定ZNFD基因在293T細(xì)胞中表達(dá)。 本課題對ZNFD基因的功能做了初步的研究。確定ZNFD基因的染色體定位和基因組序列分析，并對結(jié)構(gòu)域、基因表達(dá)譜和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測。并通過實驗確定了基因在多種組織中表達(dá)和亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核內(nèi)。通過制備具有一定的效價、具有高特異性的多克隆抗體，為之后的實驗奠定了基礎(chǔ)。利用人工構(gòu)建好的適用于蛋白質(zhì)相互作用研究的真核表達(dá)載體pcDNA3-