殼聚糖納米粒介導(dǎo)TGF-β1-miR-493靶向干預(yù)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討殼聚糖（chitosan,CS)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-P,TGF-β1)的藥物載體在結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC)肝轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的研宄。
　　方法：
　　(1)用不同序列的TGF-p1-siRNA處理小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT26，Western blot篩選沉默效果最佳的TGF-p1-siRNA序列，用作后續(xù)研宄。（2)將三聚磷

2、酸鈉(tripolyphosphate, TPP)與CS通過離子凝膠法交聯(lián)成空白納米粒，探討配制成分的改變對(duì)其理化性質(zhì)的影響。（3)將 TGF-p1-siRNA與 CS/TPP結(jié)合，配制成一定粒徑的納米粒懸液，尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，驗(yàn)證其肝靶向性及探討TPP對(duì)C S的修飾作用對(duì)肝靶向性的影響，以篩選出最佳的肝靶向性納米粒的配制條件。(4)用不同P H值的冰醋酸溶液溶解CS，配置CS/TPP/siRNA納米粒懸液，探討不同PH值對(duì)siRN

3、A包裹率的影響；將上述CS/TPP/siRNA懸液再次溶解在不同PH值的醋酸溶液中，探討PH值的改變對(duì)siRNA釋放率的影響。（5)將上述篩選的肝靶向性好、釋放率高的CS/TPP/siRNA納米粒懸液經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)C R C肝轉(zhuǎn)移模型小鼠體內(nèi)，探討其對(duì)C R C肝轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制。（6)將 TGF-p1siRNA體外瞬轉(zhuǎn)到CT26細(xì)胞株內(nèi)，分析CT26細(xì)胞株中TGF-P1相關(guān)miRNAs的表達(dá)圖譜，基因芯片篩選出上調(diào)倍數(shù)>2倍的mi

4、RNAs，采用qRT-PCR法驗(yàn)證TGF-P1沉默的細(xì)胞株中和注射CS/TPP/TGF-p1siRNA納米粒的肝轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本中最有效的差異性miRNA(miR-493-5p)。(7)將篩選出的miRNA(miR-493-5p)的成熟體(mimics, M)體外瞬轉(zhuǎn)到CT26細(xì)胞中，采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-493-5p的表達(dá)；采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CT26細(xì)胞的體外增殖情況；用Transwell迀移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)后細(xì)胞的體外迀移能力的

5、改變。（8)將 CT26細(xì)胞皮下接種到裸鼠用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，瘤內(nèi)注射CS/TPP/M的納米粒懸液，通過對(duì)皮下成瘤的體積統(tǒng)計(jì)初步估計(jì)miR-493-5p對(duì)致瘤性的影響。(9)生物信息技術(shù)預(yù)測(cè)miR-493-5p的革巴基因，western b lo t對(duì)其進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　(1) Western blot結(jié)果顯示TGF-p1-mus-1998 siRNA在CT26細(xì)胞中的基因沉默效果最好。（2)馬爾文激光粒度儀結(jié)果顯

6、示，CS/TPP納米粒的粒徑和Z e ta電位主要隨著C S濃度的改變而改變。（3)250nm粒徑的CS/TPP納米粒有良好的肝臟靶向性，并且TPP修飾后，能夠增加納米粒的這一性能。（4) P H敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PH6.8這一接近腫瘤弱酸微環(huán)境的P H值下，納米粒的釋放率最高。（5)肝轉(zhuǎn)移模型小鼠在接受CS/TPP/siRNA尾靜脈注射后，比單純的CS/TPP和 siRNA組注射腫瘤抑制效果更好。（6) m iR N A芯片結(jié)果顯

7、示，TGF-p1-siRNA處理的CT26細(xì)胞株中6個(gè)miRNA(miR-10a-3p, miRNA-871-3p, miR-678, miR-493-5p*，miR-M1-7-3p和 miR-1983)過表達(dá)，其中 miR-493-5p和miR-1983經(jīng) qRT-PCR檢測(cè) TGF-P1沉默的細(xì)胞株和組織后得到驗(yàn)證。（7) qRT-PCR結(jié)果顯示，M顯著增加了miR-493-5p的表達(dá)；MTT結(jié)果顯示，經(jīng)M轉(zhuǎn)染的CT26細(xì)胞體外增殖

8、能力下降；Transwell結(jié)果顯示經(jīng)M轉(zhuǎn)染后CT26細(xì)胞的體外迀移能力下降。（8)經(jīng)CS/TPP/M瘤內(nèi)注射后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，M組的腫瘤體積減小。（9)經(jīng)預(yù)測(cè)，miR-493-5p的候選靶基因有四個(gè)，分別為SPRK2(Serine/arginine protein-specific kinase2)、Pumilio2(pumilio RNA-binding family member2)、FUBP1(far upstream el

9、ement binding protein1)和Pescadillo1。經(jīng)驗(yàn)證，Srpk2和 Pumilio2是miR-493-5p的有效革巴基因。
　　結(jié)論：
　　(1)通過對(duì)CS濃度的改變能配制出不同粒徑和Zeta電位的納米粒，其中250nm的經(jīng)過TPP修飾后的納米粒具有更好的肝臟靶向性。（2)在P H接近腫瘤微環(huán)境PH值的溶液中，納米粒的釋放率顯著增加，說明了其潛在的腫瘤靶向性。（3)CRC肝轉(zhuǎn)移模型的成瘤結(jié)果顯示，C

10、S/TPP/TGF-p1siRNA納米粒系統(tǒng)能夠抑制C T26細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。（4) m iR N A芯片和qRT-PCR成功篩選出TGF-P1相關(guān)的miR-493-5p作為抑癌基因進(jìn)行后續(xù)研宄。（5)在體外，miR-493-5p的M顯著增加miR-493-5p的表達(dá)，抑制CT26細(xì)胞的細(xì)胞活性和迀移能力。（6)在體內(nèi)，CS/TPP/M納米粒系統(tǒng)能抑制CT26細(xì)胞的致瘤性。（7) Srpk2和 Pumilio2是miR-493-5p