西青果抗炎活性成分的分離鑒定及體內(nèi)外抗炎作用研究.pdf

1、目的：西青果為訶子屬植物訶子Terminalia chebula Retz未木質(zhì)化的幼果經(jīng)水燙、曬干后的干燥幼果，具有清熱生津，解毒的作用，臨床上用于陰虛白喉。目前，對(duì)西青果的化學(xué)成分及相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)研究較少，但對(duì)其成熟果實(shí)訶子的研究較多，研究文獻(xiàn)顯示訶子果實(shí)所含化學(xué)成分主要為酚酸類化學(xué)成分，這類成分具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物活性。有文獻(xiàn)研究證實(shí)，訶子含水乙醇提取物能對(duì)抗巨噬細(xì)胞源性促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，具有抗炎活性。體外細(xì)胞試驗(yàn)

2、文獻(xiàn)也證實(shí)，訶子中主要化學(xué)成分之一訶黎勒酸具有同時(shí)抑制炎癥發(fā)生過程中的兩種關(guān)鍵性酶:5-脂氧合酶(5-LOX)和2-環(huán)氧合酶(COX-2)活性的能力，可起到減輕炎癥反應(yīng)的作用。
　　本文探討了西青果抗炎活性成分的提取、分離和鑒定，并在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平對(duì)其主要成分柯子寧(Chebulanin)的抗炎作用進(jìn)行研究，為闡明西青果藥效物質(zhì)及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　方法和結(jié)果：
　　第一部分 西青果抗炎活性成分的分離及結(jié)

3、構(gòu)鑒定
　　方法：
　　1.西青果總酚酸類化合物的提取
　　西青果藥材粗粉經(jīng)70％丙酮浸漬提取3次;提取液減壓濃縮（控制溫度不高于50℃）至無丙酮味。濃縮液適量，先用苯萃取3次，下層藥液用乙酸乙酯多次萃取，合并乙酸乙酯，減壓濃縮（控制溫度不高于50℃），得黃褐色固體。
　　2.西青果總酚酸類成分的HPLC檢測
　　色譜柱為Ultimate LP-C18(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇（流動(dòng)相

4、A）和0.6％磷酸（流動(dòng)相B），在流速1.2mL/min，檢測波長278nm，柱溫40℃的條件下進(jìn)行梯度洗脫。
　　3.西青果酚酸類化合物的分離
　　4.單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
　　結(jié)果：
　　1.總酚酸類提取物色譜圖
　　在西青果總酚酸類提取物色譜圖中，用對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照，確定了部分色譜峰的歸屬，依次為沒食子酸(tR7.45min)、柯里拉京(tR20.59min)、柯子寧(tR21.53min)、訶黎勒酸(

5、tR29.76min)、訶子酸(tR37.25min)。
　　2.大孔吸附樹脂柱分離結(jié)果
　　西青果總酚酸類提取物經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離，合并洗脫液，得到了化合物Ⅰ（白色針狀結(jié)晶）、化合物Ⅱ（白色粉末狀固體）、化合物Ⅲ（類白色無定形粉末）和化合物Ⅳ（白色片狀結(jié)晶）。
　　3.單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果
　　第二部分 西青果提取物柯子寧抑制LPS對(duì)單核/巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路及細(xì)胞因子的作用研究
　　方法：

6、　　1.不同濃度柯子寧對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長的影響
　　配制系列濃度的柯子寧溶液(1000μM，500μM，200μM，100μM，50μM，10μM，1μM)以及陽性對(duì)照藥地塞米松溶液(10μM，5μM，1μM，0.5μM，0.1μM，0.01μM，0.001μM)。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，換成以上含藥物培養(yǎng)基于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。按照CCK8說明書測定450nm處的吸光度，計(jì)算抑制率。陰性對(duì)照組為PBS，

7、每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。抑制率(％)=(1-T/C)×100％，其中T表示實(shí)驗(yàn)孔的吸光度，C表示對(duì)照孔的吸光度。
　　2.Real-time PCR法測定柯子寧對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA水平的影響
　　5×105個(gè)RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板，過夜培養(yǎng)12小時(shí)后，每孔加入不同濃度的柯子寧（終濃度分別為100μM，50μM，10gM），0.5μM的地塞米松作為陽性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照，于37℃，

8、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。以100ng/mL的LPS刺激細(xì)胞20小時(shí)后，收集細(xì)胞提取mRNA，行RT-PCR檢測細(xì)胞炎癥因子TNF-α、COX-2的mRNA表達(dá)情況。每個(gè)樣本均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。
　　3.ELISA法測定柯子寧對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響
　　4.Western Blot法檢測柯子寧對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路磷酸化水平的影響
　　結(jié)果：
　　1.柯子

9、寧對(duì)RAW264.7細(xì)胞體外增殖的影響
　　柯子寧在100μM以下，地塞米松在0.5μM以下時(shí)，抑制率小于10％，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化，與空白對(duì)照組相比無顯著性差異(p＜0.05)。因此，最后確定柯子寧使用100μM，地塞米松使用0.5μM，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最大藥物濃度。
　　2.柯子寧對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響
　　0.5μM地塞米松可以顯著性降低TNF-a和COX-2 mRNA

10、的水平，可以作為陽性對(duì)照。100μM、50μM以及10μM的柯子寧均能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-a的mRNA水平(P＜0.01)，且呈比較明顯的濃度依賴效應(yīng)。對(duì)于COX-2 mRNA水平變化，有著相同的趨勢(shì)，即100μM、50μM和10μM的柯子寧預(yù)處理細(xì)胞，能夠以一種濃度依賴性的方式顯著降低COX-2 mRNA水平(P＜0.01)。
　　第三部分 西青果提取物柯子寧治療關(guān)節(jié)炎模型小鼠的藥效及機(jī)制研究
　　方法：

11、
　　1.膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型的制備
　　DBA/1小鼠按Brand等報(bào)道的方法造模，經(jīng)初次免疫誘導(dǎo)劑初次免疫、加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)劑加強(qiáng)免疫，制備CIA動(dòng)物模型。
　　2.柯子寧對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的治療
　　將30只SPF級(jí)DBA/1雄性小鼠（6周，18±2g）隨機(jī)分為五組，分別為對(duì)照組，模型組(CIA)，低劑量組（柯子寧，40mg/kg）、中劑量組（柯子寧，80mg/kg）和高劑量組（柯子寧，16

12、0mg/kg）;對(duì)照組和模型組灌胃給藥，模型組給予低、中、高三個(gè)劑量的柯子寧溶液（柯子寧溶解于1％羧甲基纖維素）;從初次免疫第39天（全部發(fā)病）開始給藥，每天一次，持續(xù)28天，給藥完成后繼續(xù)觀察2周，于初次免疫第80天斷頸處死小鼠，取雙側(cè)踝關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)，用于Micro-CT掃描、病理切片。
　　3.體征觀察及關(guān)節(jié)炎程度評(píng)分
　　每天觀察各組小鼠飲食、活動(dòng)及毛發(fā)改變，每周兩次采用文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。
　　4.Mic

13、ro-CT影像學(xué)檢測
　　選取小鼠右后肢，使用Viva40 Micro CT儀對(duì)小鼠關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描并3D重建;采用SIPL軟件將骨組織與軟組織區(qū)分;同時(shí)，分析骨密度(BS)骨表面積/骨密度(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)。
　　結(jié)果：
　　1.CIA小鼠臨床表現(xiàn)
　　經(jīng)小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)價(jià)，初次免疫無任何小鼠發(fā)展為關(guān)節(jié)炎;加強(qiáng)免疫（第21天）后第二天即有小鼠開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥，至初次免疫第35天左右，實(shí)驗(yàn)組24

14、只小鼠全部發(fā)展為關(guān)節(jié)炎，造模率100％。
　　2.高中劑量柯子寧能有效緩解CIA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥
　　結(jié)果顯示，給藥28天以后，中劑量組和高劑量組與模型組比，能顯著降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。但低劑量組與模型組比，效果不明顯。治療結(jié)束后觀察兩周，結(jié)果顯示，高劑量和中劑量組小鼠炎癥指數(shù)維持在5-6分水平，與模型組（11分）比有顯著差異(p＜0.05)。低劑量組小鼠炎癥仍比較嚴(yán)重（9-10分），癥狀未得到明顯

15、改善。
　　3.Micro-CT影像學(xué)檢測
　　三維重建圖中可以看出，柯子寧中劑量組和高劑量組治療后小鼠骨表面侵蝕程度得到顯著緩解和改善。相關(guān)參數(shù)值BV, BS/BV以及Tb.Th的結(jié)果顯示，發(fā)病早期即給予柯子寧治療的小鼠與正常小鼠相比，仍有一定的骨損失，但與模型組相比，體積明顯增加，骨小梁厚度也明顯增厚。
　　結(jié)論：
　　1.利用含水丙酮冷浸提取、低溫濃縮回收丙酮、乙酸乙酯萃取和低溫濃縮的方法得到酚酸提取物。利

16、用大孔吸附樹脂等分離方法，對(duì)西青果酚酸提取物進(jìn)行分離、純化，得到酚酸類化合物單體，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。最終獲得四種單體:沒食子酸(Gallicacid)、柯子寧(Chebulanin)、訶黎勒酸(Chebulagic acid)和訶子酸(Chebulinic acid)。
　　2.RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，柯子寧可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-a mRNA水平，和TNF-a和IL-6蛋白表達(dá)水平;也可以顯著性抑制炎癥關(guān)鍵