玉米SBEⅡb不同類型RNAi載體的構(gòu)建及原位轉(zhuǎn)化方法的研究.pdf

1、玉米是一種重要的糧食作物，用途十分廣泛。隨著玉米加工業(yè)的快速發(fā)展，對玉米品質(zhì)提出了更高的要求。傳統(tǒng)的玉米育種改良已難以滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需要，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合可極大地加快作物的育種進(jìn)程。但現(xiàn)有玉米轉(zhuǎn)化方法均存在一定的局限性，成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米轉(zhuǎn)化應(yīng)用上的瓶頸之一。本研究通過構(gòu)建兩種淀粉分支酶干涉載體，以提高玉米胚乳直鏈淀粉含量；借鑒其它植物原位轉(zhuǎn)化成功經(jīng)驗，探討了原位轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于玉米轉(zhuǎn)基因的效果，獲得主要結(jié)果如下：

2、 1.成功的構(gòu)建了表達(dá)型雙片段干涉載體p1300(bar)+HMW+2F(16+20)和單片段載體p1300(bar)+HMW+2F(16)，兩種載體均含有胚乳特異性啟動子(麥谷蛋白Glu啟動子)，用于玉米胚乳的特異性表達(dá)。兩種載體均含有bar基因作為選擇標(biāo)記，可以用于玉米轉(zhuǎn)化子的田間大規(guī)模篩選。利用直接導(dǎo)入法將構(gòu)建的干涉載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，該轉(zhuǎn)化菌可用于下一步的玉米轉(zhuǎn)化。 2.確定了除草劑(PPT)對玉米幼

3、苗(11～12d)適宜的篩選濃度。通過不同濃度PPT篩選玉米對照株，得出適宜篩選濃度為75μg/mL，利用此濃度篩選玉米植株，建立了用于轉(zhuǎn)基因植株的大規(guī)模篩選體系，既能篩選出轉(zhuǎn)化株，又能淘汰大部分非轉(zhuǎn)化株。 3.探索了三種技術(shù)方法(棉球涂抹花絲法、剝皮去花絲涂抹法、剝皮去花絲涂抹+滴液法)用于玉米原位轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明最后一種方法效果最好，使用這種方法的處理組合之一的轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR陽性率達(dá)3.78‰，初步建立了適合于玉米原位轉(zhuǎn)化的技

4、術(shù)方法。 4.通過對剝皮去花絲涂抹+滴液法各單因素對轉(zhuǎn)化率影響分析后，初步認(rèn)為比較合適的處理培養(yǎng)基和處理方法是：200μnml/LAS+1/5MS大量元素+MS其它成分+2,4-Dlmg/L+10mmol/L果糖+10mmol/L葡萄糖+50g/L蔗糖+0.01％Tween20，誘導(dǎo)5h，每個果穗處理2次。 5.通過對部分T1代轉(zhuǎn)化子玉米籽粒胚乳直鏈淀粉含量和PCR擴(kuò)增試驗表明，玉米籽粒胚乳直鏈淀粉含量較高(38％以上)

5、的籽粒胚乳基因組PCR均呈陽性。使用雙片段干涉載體p1300(bar)+HMW+2F(16+20)和單片段干涉載體 p1300(bar)+HMW+2F(16)轉(zhuǎn)化獲得的部分轉(zhuǎn)化子玉米籽粒胚乳直鏈淀粉含量均較非轉(zhuǎn)化對照高，但兩種干涉載體干涉效果差異不顯著。 綜上所述，本研究成功地構(gòu)建了兩種干涉載體，并將其分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。通過對玉米原位轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行探索，初步建立了適合于玉米原位轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法和轉(zhuǎn)化體系。對T1代