長鏈非編碼RNA在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中差異表達(dá)的研究.pdf

1、頜面部骨缺損主要由外傷、腫瘤、先天畸形等引起，它不僅會造成顏面畸形，還可引起語言、咀嚼、呼吸等功能障礙，對患者的生理和心理等各方面都會造成不良的影響。因此如何在修復(fù)骨缺損的同時(shí)兼顧功能與美觀，是人們不斷研究改進(jìn)的目標(biāo)。傳統(tǒng)的骨缺損修復(fù)方法有人工骨移植、自體骨移植、同種異體骨移植等，然而這些方法都有各自的弊端。目前，應(yīng)用最廣泛的是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human marrow-derived mesenchymal stem cells，h

2、MSCs)，其具有較強(qiáng)的成骨分化潛能，源于自體，取材方便，自我更新能力強(qiáng)，而且進(jìn)行移植時(shí)不存在免疫排斥反應(yīng)。因此，進(jìn)一步研究hMSCs的成骨分化機(jī)制將有助于hMSCs在骨組織工程中的臨床應(yīng)用。
　　目前，對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子調(diào)控機(jī)制的研究已經(jīng)有了顯著的進(jìn)展，其受多種因素調(diào)控，如生長因子(Wnt家族、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族)、轉(zhuǎn)錄因子(β-catenin、Runx2)和miRNA等。
　　而最近的研究發(fā)現(xiàn)一種新的DNA序列

3、以外的調(diào)控機(jī)制即長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)也影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。
　　因此，本研究將首次采用人類lncRNA表達(dá)譜芯片檢測技術(shù)對在hMSCs成骨分化前后發(fā)生差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行篩選，并對其進(jìn)行分析研究，為hMSCs成骨分化機(jī)制研究提供新的lncRNA靶點(diǎn)，從而為構(gòu)建更理想的組織工程骨移植物提供新的理論基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)將分為以下3個(gè)部分:
　　第一章 人骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞與成骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　研究目的:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，在體外分裂增殖能力強(qiáng)，可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，被認(rèn)為是骨組織工程中重要的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基使其向成骨細(xì)胞方向分化后進(jìn)行成骨分化鑒定，為后續(xù)lncRNA表達(dá)譜芯片檢測實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　研究方法:1.將

5、購買的原代hMSCs進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)至P2代，并將P2代hMSCs在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7、14、21天后，對其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。
　　2.以hMSCs成骨誘導(dǎo)分化7天、14天、21天后的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組（分別記為D7、D14和D21），以成骨誘導(dǎo)分化前的hMSCs作為對照組（記為D0）。通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色及茜素紅染色進(jìn)行成骨分化的鑒定。
　　研究結(jié)果:1.原代hMS

6、Cs傳代培養(yǎng)至P2代，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈形態(tài)均一的長梭形。經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切?，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞增殖加快，7天時(shí)可見細(xì)胞聚集成團(tuán)，誘導(dǎo)14天及21天時(shí)可見到棕黑色的鈣結(jié)節(jié)。
　　2.P2代hMSCs進(jìn)行ALP染色及茜素紅染色，結(jié)果均為陰性。將成骨誘導(dǎo)7、14、21天后的細(xì)胞行ALP染色，胞質(zhì)中呈現(xiàn)紅色，提示ALP染色結(jié)果為陽性;行茜素紅染色，可見紅色的鈣鹽沉積，提示茜素紅染色結(jié)果為陽性。
　　3

7、.D0、D7、D14、D21樣本RNA的A260/A280值均為1.8-2.0，說明總RNA具有較高的純度;RNA完整性:經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測，RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1，質(zhì)量符合進(jìn)一步RT-PCR實(shí)驗(yàn)及后續(xù)表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。
　　4.RT-PCR檢測hMSCs成骨誘導(dǎo)分化前后Osterix、ALP、OPN的表達(dá)變化，結(jié)果顯示與hMSCs成骨誘導(dǎo)分化前相比，成骨誘導(dǎo)分化后Osteri

8、x、ALP、OPN的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第二章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化前后差異表達(dá)lncRNA的篩選及驗(yàn)證
　　研究目的:本實(shí)驗(yàn)通過lncRNA表達(dá)譜芯片檢測技術(shù)篩選出hMSCs成骨分化前后差異表達(dá)的lncRNA表達(dá)譜特征，初步探討了lncRNA在hMSCs成骨分化過程中的重要作用。但是基因芯片檢測存在一定的假陽性率，必須通過其他的方式加以驗(yàn)證，因此我們從芯片檢測結(jié)果中隨機(jī)選取5個(gè)差異

9、表達(dá)lncRNA(2個(gè)上調(diào)的lncRNA∶ENST00000523786.1和ENST00000436715.1，3個(gè)下調(diào)的lncRNA:ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，以進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　研究方法:隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　研究結(jié)果:1.芯片檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)

10、與成骨誘導(dǎo)分化前的hMSCs相比，成骨誘導(dǎo)分化7天、14天、21天后表達(dá)上調(diào)超過2倍的lncRNA分別有923條、1393條、1338條;下調(diào)超過2倍的lncRNA分別有993條、3843條、3688條;表達(dá)上調(diào)超過2倍的mRNA分別有1462條、4093條、3354條;下調(diào)超過2倍的mRNA分別有953條、2236條、1923條。與成骨誘導(dǎo)分化前的hMSCs相比，成骨誘導(dǎo)分化7、14、21天過程中持續(xù)表達(dá)上調(diào)超過2倍的lncRNA有4

11、33條，下調(diào)超過2倍的lncRNA有232條;持續(xù)表達(dá)上調(diào)超過2倍的mRNA有956條，下調(diào)超過2倍的mRNA有229條。
　　2.RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示與D0組相比，ENST00000523786.1和ENST00000436715.1在D7、D14、D21組中表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05); ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2在D7、D14、D21組中表達(dá)明顯下調(diào)(

12、P＜0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。
　　第三章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化前后差異表達(dá)lncRNA和mRNA的生物信息學(xué)分析
　　研究目的:初步探討hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)的mRNA可能與哪些基因功能和生物學(xué)通路的改變相關(guān)。并對芯片篩選結(jié)果中表達(dá)差異較大的lncRNA附近300 kb區(qū)域蛋白編碼基因進(jìn)行分析，從而預(yù)測lncRNA作用的靶基因，這將有助于揭示一個(gè)新的受特定lncRNA分子

13、調(diào)控的hMSCs成骨分化機(jī)制。
　　研究方法:對hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行基因本體論(GeneOntology，G0)和KEGG生物學(xué)通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes Pathway analysis)。并選取芯片篩選結(jié)果中表達(dá)差異較大的lncRNA，根據(jù)其序列信息并結(jié)合芯片檢測結(jié)果中差異表達(dá)mRNA序列信息，對選取的lncRNA附近300 kb區(qū)域

14、蛋白編碼基因進(jìn)行分析。
　　研究結(jié)果:1.G0分析結(jié)果顯示:在生物學(xué)進(jìn)程(biological process，BP)方面，hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有680個(gè)基因富集于生物學(xué)進(jìn)程，其中富集評分最高的是system development這一生物學(xué)進(jìn)程，含有差異表達(dá)基因217個(gè)。在細(xì)胞組件(cellular component，CC)方面，hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有702個(gè)

15、基因富集于細(xì)胞組件，其中富集評分最高的是extracellular matrix這一細(xì)胞組件，含有差異表達(dá)基因57個(gè)。在分子功能(molecular function，MF)方面，hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有631個(gè)基因富集于分子功能，其中富集評分最高的是carbohydrate derivative binding這一分子功能，含有差異表達(dá)基因28個(gè)。
　　2.KEGG分析結(jié)果顯示:hMSCs成骨誘導(dǎo)

16、分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有427個(gè)基因富集于生物學(xué)通路，并主要富集于31個(gè)生物學(xué)通路，其中富集評分最高的是Complement and coagulation cascades這一生物學(xué)通路，含有差異表達(dá)基因21個(gè)。
　　研究結(jié)論:1.hMSCs在體外具有較強(qiáng)的成骨分化能力，在適當(dāng)培養(yǎng)條件下可分化為成骨細(xì)胞。
　　2.首次通過高通量lncRNA表達(dá)譜芯片檢測技術(shù)篩選出hMSCs成骨誘導(dǎo)分化前后差異表達(dá)lncRNA

17、的表達(dá)譜特征，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對部分差異表達(dá)lncRNA予以驗(yàn)證，證實(shí)了芯片結(jié)果的可靠性。
　　3.G0分析:hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有680個(gè)基因富集于生物學(xué)進(jìn)程，有702個(gè)基因富集于細(xì)胞組件，有631個(gè)基因富集于分子功能。KEGG分析:hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)差異表達(dá)mRNA基因中有427個(gè)基因富集于生物學(xué)通路，并主要富集于31個(gè)生物學(xué)通路。
　　4.對部分差異表達(dá)lncRN