葛仙米藻藍(lán)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象及抗氧化活性研究.pdf

1、葛仙米以其資源稀少、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、獨(dú)特的生物活性和廣泛的應(yīng)用價(jià)值而引起人們地關(guān)注。葛仙米作為一種食藥同源的傳統(tǒng)食品已有幾千年的歷史,但對(duì)其主要活性成分的研究很少。為探討葛仙米中的生物活性成分,本文以野生葛仙米為研究對(duì)象,充分利用生物大分子研究的最新技術(shù)和現(xiàn)代分離、分析手段,首次系統(tǒng)地研究了葛仙米蛋白質(zhì)的提取、分離和優(yōu)化,并對(duì)藻藍(lán)蛋白的純化和藻藍(lán)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,且分析了藻藍(lán)蛋白抗氧化活性。其主要結(jié)果如下:
　　

2、 1、葛仙米的生物學(xué)特性與生化組成研究
　　 以湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)野生葛仙米為研究對(duì)象,分析了生態(tài)條件及分布規(guī)律。葛仙米主要分布于亞熱帶二高山地區(qū),屬亞熱帶大陸性季風(fēng)濕潤(rùn)氣候；土壤含F(xiàn)e、Mn相對(duì)較高；年最高溫度36℃,最低溫度0.7℃,年均降雨量1836.4mm,年均日照1342h。葛仙米營(yíng)養(yǎng)豐富,蛋白質(zhì)、多糖含量高,達(dá)54％:富含維生素,VB11.2mg/100g,VB211.8mg/100g,Vc.550mg/100g,V

3、E7.0mg/100g,β-胡蘿卜素114mg/100g,高于一般食物；脂肪含量為5.50％,以中碳鏈為主；含大量礦質(zhì)元素和微量元素。
　　 2、葛仙米蛋白的提取、分離和優(yōu)化及藻藍(lán)蛋白的純化和鑒定
　　 試驗(yàn)選取pH值、溫度和提取時(shí)間這三個(gè)影響葛仙米蛋白得率的最重要的因素,采用三因素二次旋轉(zhuǎn)正交回歸組合實(shí)驗(yàn),優(yōu)化出葛仙米蛋白提取的最佳工藝條件為,緩沖液pH為7.3、浸提時(shí)間4.3h、鹽濃度0.21mol/L,葛仙米蛋白得

4、率達(dá)7.13％。采用反相分段梯度鹽析法,即先用20％(NH4)2SO4飽和度沉淀除去雜質(zhì),60％(NH4)2SO4沉淀PC,沉淀溶解以后第2次和第3次鹽析時(shí)逐漸變窄沉淀范圍,提高了藻藍(lán)蛋白的純度,保證了較高的得率。葛仙米蛋白提取工藝為:原料-復(fù)水-反復(fù)凍融-超聲波破壁-磷酸緩沖液浸提(4℃,4h/次,3次,pH值為7.0的0.05M磷酸鉀緩沖液+0.2M NaCl)-高速冷凍離心(14000r/min,4℃,45min)一反相硫酸銨分步

5、鹽析法-透析-冷凍干燥得粗葛仙米蛋白。
　　 利用DEAE-Cellulose52離子交換層析,采用步進(jìn)式洗脫模式成功地將葛仙米蛋白分離出葛仙米藻藍(lán)蛋白。采用羥基磷灰石(HA)柱層析、DEAE-Sepharose FF,進(jìn)一步純化后得到均一的級(jí)分。經(jīng)柱層析法、分光光度法、熒光光譜法和電泳法鑒定其為具有色譜純和電泳純的樣品。SDS-PAGE凝膠電泳法測(cè)定了葛仙米藻藍(lán)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量,即為38.245K,是為兩條不同分子質(zhì)量(即19

6、.852K和18.383K)的肽鏈通過二硫鍵連接而成。
　　 3、葛仙米藻藍(lán)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的表征
　　 采用MALDI-TOF-MS測(cè)定NSPC的分子質(zhì)量,獲得了NSPC精確分子質(zhì)量為37715。根據(jù)氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定的氨基酸組成和精確分子質(zhì)量計(jì)算出NSPC分子總共有331個(gè)氨基酸殘基,分別是由40個(gè)Asp、22個(gè)Thr、18個(gè)Ser、22個(gè)Glu、1個(gè)Gly、31個(gè)Ala、27個(gè)Cys、17個(gè)Val、13個(gè)Ile、22

7、個(gè)Leu、5個(gè)Tyr、7個(gè)Phe、7個(gè)Lys、24個(gè)His、51個(gè)Arg、14個(gè)Pro、1個(gè)Met和9個(gè)Trp組成。胰蛋白水解酶分別酶解NSPC-1和NSPC-2后,分別采用MALDI-TOF.MS分析,其肽指紋譜圖顯示胰蛋白酶可將NSPC-1和NSPC-2水解成大小不等的多條肽段,質(zhì)量數(shù)在800以上的NSPC-2有11段,即水解的肽質(zhì)量分別為899.54、1454.77、1544.9、1683.87、1803.93、1819.91、1

8、987.92、2003.90、2536.26、2915.42和3492.72。NSPC-2的氨基酸序列為:
　　 1MKTPLTEAVS IADSQGRFLS STEIQVAFGR ERQAKAGLEAAKALTSKALTSKADS51LISGAAQAVY NKFPVTTQMQ GPNYAADQRGKDKCARDIGY YLRMVTYCLI101AGGTGPMDEY LIAGIDEINR TFELSPSWYI EALKYIKAN

9、H GLSGDAAVEA151 NSYLDYAINA LS
　　 肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列標(biāo)簽結(jié)合用于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,證明NSPC-2為極大螺旋藻α鏈,而NSPC-1未從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到與此匹配的蛋白。
　　 4、葛仙米藻藍(lán)蛋白分子構(gòu)象的表征
　　 采用FTIR、CD、AFM、SEM、X-衍射、DSC和FR等分析技術(shù),測(cè)定了NSPC的空間結(jié)構(gòu)及變性溫度。FTIR和CD分析結(jié)果顯示NSPC主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主,β-

10、折疊或卷曲結(jié)構(gòu)含量較少。熒光光譜顯示,在水溶液中NSPC分子中的Trp殘基兩種類型都存在,既有暴露于分子外部的Trp殘基,也有處于疏水內(nèi)部的Trp殘基。其溶液構(gòu)象在pH7時(shí)最穩(wěn)定,但酸堿度對(duì)其構(gòu)象影響較小,在pH<7時(shí)NSPC構(gòu)象相對(duì)變化略大于在堿性環(huán)境。有機(jī)溶劑對(duì)其構(gòu)象變化影響較大。
　　 通過AFM觀察,在中性環(huán)境下,NSPC分子呈鏈狀形式存在:DSC結(jié)果表明,NSPC變性溫度為41.6℃。
　　 通過掃描電鏡觀察,

11、NSPC聚集態(tài)主要以片層、針狀和蜂窩狀形式。X-射線衍射分析結(jié)果表明經(jīng)凍干得到的NSPC粉末結(jié)晶度高,且結(jié)晶區(qū)分子的規(guī)整性較高。
　　 5、葛仙米蛋白穩(wěn)定性研究
　　 研究了溫度、pH、光強(qiáng)、乙醇濃度、中性鹽濃度、飽和度的硫酸銨溶液和不同蔗糖濃度等因子對(duì)其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,葛仙米蛋白在自然光照下,溫度低于40℃,pH5～8,乙醇濃度小于40°,低濃度中性鹽和低濃度蔗糖溶液中能保持較好地穩(wěn)定性,60％飽和度的硫酸銨溶

12、液有利于其穩(wěn)定性。
　　 6、葛仙米藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性
　　 非脂質(zhì)體系抗氧化實(shí)驗(yàn)、體外抗氧化實(shí)驗(yàn)等結(jié)果表明葛仙米蛋白粗提物具有良好的抗氧化性能作用。清除氧自由基的能力為:粗提物>藻紅蛋白>藻藍(lán)蛋白；這可能是由于粗提物中還含有多糖和酚類物質(zhì)等共同作用的結(jié)果,葛仙米藻藍(lán)蛋白對(duì)清除O-2、·OH自由基和H2O2具有較好的量效關(guān)系。在體外反應(yīng)體系中,NSPC能顯著地降低MDA生成和血和肝中過氧化物的含量,起到保護(hù)細(xì)胞膜和紅血