復(fù)葉槭組織培養(yǎng)再生體系建立及其遺傳轉(zhuǎn)化初步研究.pdf

1、本研究通過不定芽和愈傷組織兩種途徑，首次建立了復(fù)葉槭的組織培養(yǎng)再生體系，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和針刺法首次對槭樹科植物進(jìn)行了抗蟲基因的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了經(jīng)PCR和PCR-Sourthern檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。本論文研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.復(fù)葉槭不定芽途徑再生體系的建立 (1)以莖節(jié)、頂芽為外植體，通過比較不同激素種類和濃度對增殖率和分化率的影響，篩選出適合不同外植體的最佳培養(yǎng)基和激素組合，從而建立起

2、復(fù)葉槭不定芽再生體系。結(jié)果表明，適合莖節(jié)和頂芽的增殖培養(yǎng)基均是MS基本培養(yǎng)基附加0.1mg/L6-BA和0.01mg/LNAA，分化培養(yǎng)基分別是附加0.1mg/LTDZ和0.01mg/L2,4-D的MS培養(yǎng)基和附加0.01mg/LTDZ的MS培養(yǎng)基，最佳的生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加0.1mg/LNAA，生根率為89％。 (2)以莖節(jié)為外植體，比較了液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TDZ同一濃度下，液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)的分

3、化率高，產(chǎn)生不定芽的時(shí)間相對較早。 2.復(fù)葉槭莖段等誘導(dǎo)的愈傷組織途徑再生體系的建立以莖段、葉片、子葉、葉柄為外植體，通過比較不同激素種類和濃度對不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和分化率的影響，篩選出適合不同外植體的最佳培養(yǎng)基和激素組合，從而通過愈傷組織再生途徑初步建立起復(fù)葉槭的組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明，不同外植體在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的顏色和質(zhì)地略有差異，脫分化和再分化能力不同。莖段的脫分化和再分化能力相對最強(qiáng)，葉柄最差。適合莖

4、段再分化的最佳培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基附加0.0005mg/LTDZ和0.01mg/LNAA，分化率是22.8％，其他外植體脫分化后沒能再分化。 3.莖段等誘導(dǎo)的愈傷組織解剖學(xué)研究通過組織切片技術(shù)研究了不同顏色和質(zhì)地的愈傷組織以及莖節(jié)在不同時(shí)期誘導(dǎo)的愈傷組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，不同顏色和質(zhì)地的愈傷組織的細(xì)胞排列方式、細(xì)胞大小等不同，淺棕色疏松等淺色系的愈傷組織多為胚性愈傷組織，從而為從顏色和質(zhì)地上確定復(fù)葉槭胚性愈傷組織奠定基礎(chǔ)。

5、莖節(jié)在不同時(shí)期的細(xì)胞分裂有一定差異，通過組織學(xué)觀察到了不定芽的形成多是經(jīng)過愈傷組織途徑。 4.復(fù)葉槭遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究(1)篩選了適合復(fù)葉槭不同轉(zhuǎn)化體的卡那霉素濃度。復(fù)葉槭的葉片、莖段和莖節(jié)、愈傷組織分別選用15mg/L、25mg/L、15mg/L作為篩選濃度較為適宜。比較了不同菌液濃度和感染時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，用LB液體培養(yǎng)基和過夜培養(yǎng)的菌液以1：1稀釋后感染10min轉(zhuǎn)化率相對較高。 (2)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法