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文檔簡介
1、自上世紀(jì)以來的流行病學(xué)研究表明,心血管疾病的發(fā)病率和死亡率存在著性別差異。絕經(jīng)前女性心血管疾病的發(fā)病率明顯低于同齡男性。而且,不管是由于自然的因素還是外科手術(shù)抑或是卵巢功能受損從而導(dǎo)致雌激素分泌的停滯,都會使女性患心血管疾病的危險(xiǎn)性增加。女性心臟疾病的發(fā)病比男性平均晚10年,絕經(jīng)后婦女心血管疾病的發(fā)病率是同齡的絕經(jīng)前婦女的4倍以上。雌激素水平下降是絕經(jīng)后婦女最主要的生理變化。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),天然雌激素如17β-雌二醇可直接作用于心臟或影響
2、血管系統(tǒng)從而對心血管疾病的發(fā)生產(chǎn)生影響。近年來研究認(rèn)為雌激素可通過防止動脈硬化形成和血管重塑而起保護(hù)作用,包括雌激素的抗凋亡、抗氧化,改變脂蛋白代謝、血小板的粘附和聚集,血管內(nèi)皮激活一氧化氮合成從而導(dǎo)致血管舒張,抑制心肌肥大和減少心肌缺血等。因此,男性與絕經(jīng)前同齡女性之間心血管疾病的發(fā)病率和死亡率之間的差異主要是由于雌激素的保護(hù)作用。然而,絕經(jīng)后女性大樣本隨機(jī)臨床試驗(yàn)的研究表明雌激素和孕激素的聯(lián)合使用結(jié)果對激素替代的心血管保護(hù)作用提出了
3、質(zhì)疑,認(rèn)為激素替代不僅不對心血管有保護(hù)作用,反而增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率,引起心臟疾病、乳腺癌、腦血栓和癡呆等發(fā)病的危險(xiǎn)性。這些有關(guān)雌激素對心血管作用負(fù)面研究結(jié)果引發(fā)了人們對激素替代治療的質(zhì)疑。為更好地解決激素替代治療引發(fā)的公共衛(wèi)生危機(jī),關(guān)鍵是弄清楚雌激素對心血管系統(tǒng)的快效應(yīng)和慢效應(yīng)的復(fù)雜機(jī)制,因此需要對雌激素的正效應(yīng)和負(fù)作用進(jìn)行全面評估。雌激素對血管系統(tǒng)的作用已有較全面的認(rèn)識,但對心臟的直接作用還知之甚少。近年來,研究的焦點(diǎn)已開
4、始從血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)向心肌細(xì)胞。一般認(rèn)為,細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)對維持心肌細(xì)胞的正常功能起著重要的作用,心臟正常的收縮功能有賴于心肌細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)和激活一收縮耦聯(lián)。雌激素對心肌細(xì)胞離子通道的瞬時(shí)效應(yīng)已有廣泛的研究,然而對其長期效應(yīng)卻知之甚少,因此闡明雌激素影響心肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)作用機(jī)制是十分必需的。
在我們以往的研究中,利用cDNA微陣列技術(shù)觀察到:去勢3個(gè)月后,左室心肌細(xì)胞的上百個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變,其中包括Na+,K+-ATP酶、Ca
5、2+-ATP酶、碳酸酐酶、L型鈣通道蛋白、延遲整流鉀通道蛋白和電壓門控鈉通道蛋白以及Na+-H+交換蛋白和Na+-Ca2+交換蛋白等的表達(dá)。心肌細(xì)胞電解質(zhì)穩(wěn)定對其功能發(fā)揮起至關(guān)重要的作用。對心肌細(xì)胞H9c2的研究發(fā)現(xiàn)生理濃度的雌激素能上調(diào)Na+,K+-ATP酶、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶和碳酸酐酶的表達(dá)和活性,這些酶均可能參與細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,生理濃度的雌激素水平可能維護(hù)心肌細(xì)胞內(nèi)的離子濃度、pH值和膜電生理等
6、特性而保護(hù)心肌細(xì)胞;否則,會導(dǎo)致電解質(zhì)紊亂、電生理異常、心肌細(xì)胞損傷乃至死亡。因此,本研究的目的是尋找雌激素對心肌細(xì)胞內(nèi)游離離子穩(wěn)態(tài)影響的直接證據(jù)。我們用鼠H9c2心肌細(xì)胞為研究對象,檢測不同濃度雌激素對細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+、K+、H+和Cl-等離子濃度和Ina、Ica,L、Ik等離子電流的影響。
第一章、17β-雌二醇對心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)游離離子濃度的影響
目的:研究不同濃度的17β-雌二醇對心肌細(xì)胞H9
7、c2內(nèi)Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-等游離離子濃度的影響。
方法:Hgc2心肌細(xì)胞分別在0,0.01 nM,1 nM,100 nM,1000 nM17β-雌二醇(E2)條件下培養(yǎng)24小時(shí),接著分別用熒光探針Fluo-3,SBFI,PBFI,SNARF-1,MQAE孵育細(xì)胞,用熒光法測定細(xì)胞內(nèi)游離離子(Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-)濃度。
結(jié)果:心肌細(xì)胞H9c2分別在0、0.01 aM、1 aM、
8、100 nM、1000 nM17β-雌二醇中培養(yǎng)24小時(shí)后,心肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度分別是(157.5±5.7)nM,(153.8±6.2)nM,(148.5±8.7)nM,(144.5±7.8)nM,(167.5±9.0)nM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與無17β-雌二醇組相比,0.01nM、1 nM和100 nM17β-雌二醇組的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]下降(p<0.05)。無E2組和0.01 nM E2組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]顯著高于1 nM E2組
9、(p<0.05)。1 nm和100 nM17β-雌二醇組之間細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]無顯著性差別(p>0.05),而1000 nM17β-雌二醇組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]卻比無E2組和0.01 nME2組,1nM E2組和100nM E2組有顯著性升高(p<0.05)。
結(jié)論:研究表明1nM和100 nM的17β-雌二醇能維持H9c2細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-等離子的濃度在生理濃度范圍,1 nM和100 nM17β-雌
10、二醇組間細(xì)胞內(nèi)離子濃度無顯著性差異。H9c2細(xì)胞在無E2、0.01 nME2或1000 nM E2條件下,細(xì)胞內(nèi)游離離子平衡出現(xiàn)紊亂。因此,17β-雌二醇對H9c2細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+、K+、H+、Cl-等游離離子濃度的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。
第二章、17β-雌二醇對H9c2心肌細(xì)胞的電壓門控鈉電流、L型鈣電流、延遲整流鉀電流等離子通道電流的影響
目的:研究不同濃度的17β-雌二醇對H9c2心肌細(xì)胞的
11、電壓門控鈉電流(Ina)、L型鈣電流(Ica,L)、延遲整流鉀電流(Ik)等離子通道電流的影響。
方法: H9c2心肌細(xì)胞分別在0,0.01 nM,1 nM,100 nM,1000 nM17β-雌二醇(E2)條件下培養(yǎng)24小時(shí),用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測定H9c2細(xì)胞的電壓門控鈉電流(Ina)、L型鈣電流(Ica,L)、延遲整流鉀電流(Ik)等離子通道電流。
結(jié)果:電壓依賴的Ina的測定:維持電位(holding
12、potential)為-80mV,每隔10mV,連續(xù)除極至20mV。內(nèi)向Ina大約在-70mV出現(xiàn),在-30mV達(dá)到最大,而在+20mV逆轉(zhuǎn)。用0、0.01 nM、1 nM、100 nM、1000nM E2處理H9c2細(xì)胞24h后,其平均最大Ina分別是(3.61±0.42)(pA/pF),(2.80±0.29)(pA/pF),(2.27±0.30)(pA/pF),(2.08±0.31)(pA/pF),(1.51±0.20)(pA/pF
13、)。與無E2組相比,0.01 nM、1 nM、100 nM、1000 nM E2處理組的平均最大Ina有顯著性下降(p<0.05),17β雌二醇能以濃度依賴的方式抑制Ina。另外,17β-雌二醇不改變Ⅰ-Ⅴ曲線(n=12-16)。
結(jié)論:用0、0.01 nM、1 nM、100 nM和1000 nM E2處理H9c2細(xì)胞24h后,Ina、Ica.L、IK隨17β-雌二醇濃度升高而降低。研究表明電壓門控鈉電流(Ina)、L型鈣
14、電流(Ica,L)、延遲整流鉀電流(Ik)等離子通道電流以濃度依賴的方式隨17β-雌二醇濃度升高而降低。
第三章、不同濃度的17β-雌二醇對心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞形態(tài)、損傷及死亡程度的影響
目的:研究不同濃度的17β-雌二醇對心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞形態(tài)及損傷程度的影響。
方法: H9c2心肌細(xì)胞分別在0,0.01 nM,1 nM,100 nM,1000 nM17β-雌二醇(E2)條件下培養(yǎng)24小時(shí),
15、接著分別用熒光探針Fluo-3,SBFI,PBFI,SNARF-1,MQAE孵育細(xì)胞,用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。通過釋放到培養(yǎng)基的LDH活性測定和PI染色細(xì)胞觀察17β-雌二醇對細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡的影響。
結(jié)果:將H9c2與不同的熒光探針孵育后,用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)在無E2或在1000 nM E2時(shí)有細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,細(xì)胞變得平而圓。心肌細(xì)胞H9c2分別在0、0.01 nM、1 nM、100
16、 nM、1000nM17β-雌二醇中培養(yǎng)24d,時(shí)后,細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH釋放率分別是(11.9±1.1)%,(11.4±1.5)%,(10.2±0.9)%,(9.94±1.6)%,(13.4±1.7)%。無E2組和0.01 nM E2組之間,培養(yǎng)基中LDH釋放率無顯著性差異(p>0.05),而1nME2組和100 nM E2組中LDH釋放率顯著低于無E2組和0.01nM E2組(p<0.05)。但1 nM E2和100 nM E2組之間
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