煙草節(jié)桿菌02181肌酸酶基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、血清和尿液中肌酐測(cè)定是臨床評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)功能的重要指標(biāo)，因而是臨床上開(kāi)展的重要生化項(xiàng)目之一。肌酐測(cè)定主要有化學(xué)法和酶法，這兩種方法都是基于比色法。化學(xué)法主要源于Jeffe反應(yīng)法，其優(yōu)點(diǎn)是成本低，操作簡(jiǎn)單，易于基層單位開(kāi)展，現(xiàn)在仍有很多基層醫(yī)院在使用，但它的缺點(diǎn)也是明顯的，即易受到樣品中非特異性物質(zhì)的干擾，也就是所謂的“假肌酐”。酶法則克服了上述缺點(diǎn)，無(wú)論是靈敏度還是特異性都有著化學(xué)法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但酶法測(cè)定肌酐也有自身的缺點(diǎn)。酶法所用

2、的工具酶主要有三種(肌酐酶，EC3.5.2.10；肌酸酶，EC3.5.3.3；肌氨酸氧化酶，EC1.5.3.1)，肌酸酶是其中非常重要的一種，主要來(lái)源于微生物，但在我國(guó)目前尚不能自主生產(chǎn)。臨床上肌酐酶學(xué)檢測(cè)，主要使用進(jìn)口原裝試劑盒或者國(guó)內(nèi)生物技術(shù)公司用進(jìn)口工具酶組裝的試劑盒，成本較化學(xué)法高出很多。國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)盟(InternationalFederationofClinicalChemists，IFCC)和我國(guó)臨床檢驗(yàn)中心(Natio

3、nalCenterforClinicalLabomtory，NCCL)推薦的肌酐測(cè)定方法是肌酐酶偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法，在這一大趨勢(shì)下，開(kāi)展具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的肌酐測(cè)定工具酶的研究具有特別重要的意義和良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。 主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果： 1.肌酸酶基因的克隆 1.1肌酸酶基因部分序列的克隆 查詢GenBank上已發(fā)表的全部肌酸酶基因序列，從中選出7個(gè)不同種屬來(lái)源的序列，將這7個(gè)序列遞交到BlockM

4、aker服務(wù)器上進(jìn)行塊狀比對(duì)，得到9個(gè)無(wú)間隙的保守區(qū)，再通過(guò)CODEHOP服務(wù)器運(yùn)算，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以提取的煙草節(jié)桿菌02181基因組DNA為模板做簡(jiǎn)并PCR，得到-414bp的片段，經(jīng)在NCBI上BLASTx，與多種不同來(lái)源的肌酸酶有著高度的同源性，證實(shí)該序列為肌酸酶基因的部分序列。 1.2肌酸酶基因全長(zhǎng)序列的克隆 根據(jù)已有結(jié)果，按照基因組步移技術(shù)要求設(shè)計(jì)該肌酸酶基因部分序列上、下游基因特異性引物GSP1、GSP2，利

5、用這一技術(shù)分別克隆出已知序列的上、下游序列，利用BLASTx、VectorNTIsuit8、primerpremier5.0等工具軟件拼接出肌酸酶基因的全長(zhǎng)序列，該基因共有1254bp(含有終止密碼子)，為一完整的開(kāi)放讀碼框架(ORF)，編碼417個(gè)氨基酸，理論分子量為46377Da。在NCBI上BLASTx結(jié)果顯示，所得肌酸酶基因與多種不同來(lái)源的肌酸酶基因高度同源，其中同源性最高的為Arthrobactersp.FB24來(lái)源的肌酸酶，

6、其氨基酸序列的一致性為79％(332/417)，同源性達(dá)到了87％(365/417)，證明我們得到是一種全新的肌酸酶基因。在此基礎(chǔ)之上，以該全長(zhǎng)序列為模板，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基的引物，其中，上游引物包含EcoRⅠ及EK酶(小腸激酶)的酶切位點(diǎn)，下游引物包含SalⅠ的酶切位點(diǎn)，以煙草節(jié)桿菌02181基因組DNA為模板，利用pfu酶克隆出含有酶切位點(diǎn)的肌酸酶基因，該基因全長(zhǎng)1288bp。經(jīng)測(cè)序表明，所得序列與預(yù)期完全一致，證明我們

7、克隆煙草節(jié)桿菌02181肌酸酶基因取得成功。 2.肌酸酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)與純化 用EcoRⅠ及SalⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物及pET42a質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并回收純化后利用T4連接酶將該肌酸酶基因連入質(zhì)粒pET42a，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，酶切及測(cè)序以確認(rèn)其正確性。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，得到一種分子量約67kDa的蛋白(帶有GST標(biāo)簽，其分子

8、量約為30kDa)，與預(yù)期完全相符。純化過(guò)程中，我們利用EK酶將GST標(biāo)簽切割下來(lái)，經(jīng)過(guò)第二輪GST純化后，可得到純度較高的不帶有任何“外來(lái)”氨基酸的肌酸酶，經(jīng)SDS-PAGE電泳，確定其單體分子量為46.4kDa。經(jīng)酶活性測(cè)定，每克濕菌可產(chǎn)生156.8U的肌酸酶，與野生型煙草節(jié)桿菌每克濕菌產(chǎn)生10.7U肌酸酶相比，產(chǎn)量提高了14.7倍，并且建立了重組肌酸酶的純化工藝，純化后的肌酸酶的比活性較純化前提高了24.7倍。經(jīng)純化得到的肌酸酶在