白星花金龜幼蟲血淋巴抗菌物質(zhì)的分離、純化及其PGRP-S基因的克隆分析.pdf

1、由基因編碼的抗菌肽首先從昆蟲中分離鑒定得到，它被認(rèn)為是宿主內(nèi)廣泛存在的一個(gè)抵御病原菌的生物化學(xué)防御機(jī)制。抗菌肽一般含有100個(gè)或者更少氨基酸殘基，在中性環(huán)境中帶正電荷，并且在低濃度下就對(duì)多種微生物和某些病毒具有廣譜的抑制作用。現(xiàn)已在所有的生物門類中分離出抗菌肽，并且在宿主防御中發(fā)現(xiàn)有它們的表達(dá)和釋放。 昆蟲幾乎存在于所有的陸生生境中，是地球上最大的生物類群，約占整個(gè)生物界物種總和的75％。它們是一類具有生態(tài)、科研、經(jīng)濟(jì)以及文化價(jià)

2、值的自然資源。更重要的是，昆蟲的血淋巴也是具有很大開(kāi)發(fā)潛力的生物資源寶庫(kù)。昆蟲的血淋巴中含有種類繁多，功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)在昆蟲的宿主防御中起到至關(guān)重要的作用。存在于昆蟲血淋巴中的生物活性成分引起了世界上研究人員極大的關(guān)注。迄今為止，已從昆蟲中分離鑒定出許多具有多種生物活性的多肽以及蛋白質(zhì)?，F(xiàn)已經(jīng)鑒定出來(lái)的昆蟲大約有1百萬(wàn)種，我國(guó)擁有約占世界1/10的昆蟲資源，在生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)方面具有極大的潛力。 以藥用昆蟲白

3、星花金龜(Protaetia brevitarsis)幼蟲為研究對(duì)象，對(duì)其血淋巴進(jìn)行抗菌生物活性物質(zhì)篩選：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白星花金龜血淋巴對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subttilis)具有較強(qiáng)的抗菌活性。 通過(guò)葡聚糖凝膠層折和反相高效液相層析等生物化學(xué)手段和研究方法，在白星花金龜幼蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)兩種抗菌活性物質(zhì)，并對(duì)其抗菌活性作了初步研究。 通過(guò)三步分離純化過(guò)程：Sephadex G-50凝膠過(guò)濾和兩步反相高壓液相層析

4、(RP-HPLC)，從白星花金龜幼蟲血淋巴中分離純化出兩種對(duì)枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)抗菌活性的物質(zhì)。借助于質(zhì)譜，得到這兩種抗菌活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為2254.0459、2262.4438道爾頓。 以來(lái)源于單個(gè)昆蟲白星花金龜幼蟲個(gè)體脂肪體中提取的mRNA為材料，建立了白星花金龜幼蟲脂肪體cDNA文庫(kù)，得到大約為1×106個(gè)獨(dú)立的克隆。這是首次構(gòu)建白星花金龜幼蟲脂肪體cDNA文庫(kù)，為白星花金龜抗菌肽基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能研究奠定了基

5、礎(chǔ)。 肽聚糖識(shí)別蛋白是一種模式識(shí)別受體，可以與肽聚糖發(fā)生特異性的結(jié)合，在先天性免疫反應(yīng)中起重要作用。通過(guò)Genbank搜索昆蟲肽聚糖識(shí)別蛋白編碼序列，通過(guò)序列分析找出保守序列設(shè)計(jì)引物，然后對(duì)來(lái)源于單個(gè)白星花金龜幼蟲脂肪體的ds cDNA進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，我們得到白星花金龜幼蟲脂肪體肽聚糖識(shí)別蛋白成熟蛋白cDNA序列。該cDNA序列由623個(gè)核苷酸組成，推導(dǎo)出來(lái)的肽聚糖識(shí)別蛋白成熟蛋白組成為174個(gè)氨基酸，通過(guò)Genbank進(jìn)