脊髓內(nèi)NF-kappa B p65信號通路在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎所致痛覺敏感中的作用.pdf

1、研究背景:
　　膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是老年人中的常見病和多發(fā)病，嚴重損害患者身心傷害，同時給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。KOA主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)慢性疼痛、活動障礙甚至殘疾，而難以忍受的慢性疼痛往往是患者就醫(yī)的主要原因。目前， KOA慢性疼痛的藥物治療效果不佳，且患者長期用藥易產(chǎn)生耐藥及嚴重的副作用。KOA后期，患者不得不選擇進行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)來改善關(guān)節(jié)的功能、緩解疼痛。然而，全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(

2、total knee replacement，TKR)后6個月內(nèi)，仍有16％-39％的患者存在膝關(guān)節(jié)疼痛。因此，目前針對KOA后期慢性、難治性疼痛缺乏行之有效的治療方法，患者只能長期忍受慢性疼痛帶來的身體上和精神上的折磨。除此之外，相關(guān)的研究還表明膝關(guān)節(jié)痛還會使得患者的死亡率增高?；诨颊邔OA慢性疼痛有效治療方案的迫切需求，臨床研究人員也漸漸開始關(guān)注KOA慢性疼痛，KOA慢性疼痛的發(fā)病機制及治療方案的研究也漸漸成為研究的熱點。臨床研

3、究發(fā)現(xiàn)，患者疼痛的嚴重程度及持續(xù)時間與關(guān)節(jié)內(nèi)部的病理改變不成正比。進一步的研究證實，疼痛相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變相比于外周因素在KOA慢性疼痛發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著更為重要的作用。目前，臨床上已經(jīng)嘗試通過對神經(jīng)系統(tǒng)的干預(yù)來治療KOA患者后期產(chǎn)生的慢性難治性疼痛。因此，探索KOA導(dǎo)致的慢性疼痛的中樞發(fā)病機制也許能夠為我們找到KOA慢性疼痛治療的理想靶點。
　　核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一

4、種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫和炎癥反應(yīng)、細胞的分裂和凋亡過程中發(fā)揮著必不可少的作用。除了發(fā)揮上述重要作用外，在神經(jīng)系統(tǒng)中NF-κB還能夠參與到學(xué)習(xí)、記憶和疼痛的形成過程中。多項研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓甚至是更高級別的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥、創(chuàng)傷等刺激因素本身及隨之產(chǎn)生炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子均可導(dǎo)致NF-κB信號通路的激活。NF-κB信號通路的激活又可以使進一步的導(dǎo)致脊髓內(nèi)炎癥反應(yīng)加重、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量增加以及離子通道功能改變，進而導(dǎo)致疼痛程度

5、加劇。當(dāng)刺激因素持續(xù)存在，NF-κB信號通路處于長期激活狀態(tài)，脊髓背角內(nèi)炎癥慢性化、神經(jīng)遞質(zhì)受體大幅度增加，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)結(jié)構(gòu)性的改變，產(chǎn)生慢性、難治性及神經(jīng)病理性疼痛。NF-κB二聚體是其最常見的活性狀態(tài)，p50/p65是最常見的二聚體形式，其中主要由p65與目的基因結(jié)合因此我們選擇NF-κB/p65作為我們的研究對象。前期研究已證實，干擾脊髓內(nèi)NF-κB/p65的表達能夠減輕風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)炎的疼痛程度，同時還能夠改善外

6、周炎癥反應(yīng)。然而，在主要表現(xiàn)為慢性退行性病變而非炎癥反應(yīng)的骨性關(guān)節(jié)炎中NF-κB/p65是否能夠發(fā)揮同樣的作用卻未見報道。本研究將在以碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate，MIA)建立的KOA大鼠模型上，對NF-κB/p65在KOA導(dǎo)致的慢性疼痛及關(guān)節(jié)破壞的進展速度上所發(fā)揮的作用進行研究。
　　研究目的:
　　本研究目的是通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射MIA建立的KOA大鼠模型，探索脊髓內(nèi)NF-κB/p65信號通路在KOA

7、導(dǎo)致的疼痛敏感的形成過程中的作用及其機制。
　　研究方法:
　　1、采用隨機數(shù)字法將健康的雌性SD大鼠為三組:對照組、KOA模型組和NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)鞘內(nèi)給藥的KOA模型組，每組50只。自大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA完成當(dāng)天起，每天鞘內(nèi)給予大鼠PDTC12μl(0.2mg/ml)直至相應(yīng)時間點。
　　2、MIA注射前1d和注射后7d、14d

8、、21d和28d通過檢測50％縮足閾值(pawwithdrawal threshold，PWT)對大鼠的機械痛域進行檢測。于相同時間點，通過直接拍照和制作病理切片的方法對大鼠關(guān)節(jié)面肉眼及顯微鏡下的病理學(xué)改變進行觀察和評估;采用Western blot技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和RT-PCR(real-timepolymerase chain reaction)技術(shù)檢測大鼠脊髓內(nèi)NF-κ B/p65的蛋白量和轉(zhuǎn)錄水平的變化;采用RT-PCR檢測I

9、L-1β(interleukin-1β)、IL-33和TNF-α(tumor necrosisfactor-α)的轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢。
　　結(jié)果:
　　MIA注射后，KOA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)的痛覺敏感程度逐漸增加，并于14d到達高峰后維持在較高水平;關(guān)節(jié)面破壞程度不斷加重、關(guān)節(jié)間隙逐漸變窄，符合臨床上KOA的變化特點。脊髓內(nèi)NF-κB/p65的蛋白水平和mRNA水平與大鼠痛覺敏感程度的變化趨勢一致，脊髓內(nèi)IL-1β、IL-33

10、和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加，峰值與NF-κB/p65一致。鞘內(nèi)注射PDTC模型組MIA注射后21d起痛覺敏感程度較模型組明顯降低，向KOA模型大鼠鞘內(nèi)注射PDTC后大鼠脊髓內(nèi)NF-κB/p65的蛋白水平和mRNA水平較模型組明顯降低。鞘內(nèi)注射PDTC模型組大鼠MIA注射后28d時脊髓內(nèi)的IL-1β、IL-33和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平較模型組也明顯降低。
　　結(jié)論:
　　骨性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致脊髓背角內(nèi)NF-κB/p65蛋白和mRNA

11、的表達量的上調(diào);鞘內(nèi)注射阻滯劑PDTC能夠下調(diào)脊髓內(nèi)NF-κB/p65蛋白和mRNA的表達量，并且在KOA中后期能夠降低大鼠的痛覺敏感程度。結(jié)果表明，脊髓內(nèi)NF-κB/p65在KOA中后期產(chǎn)生的痛覺過敏中發(fā)揮著重要的作用。此外，下調(diào)脊髓內(nèi)NF-κB/p65還能抑制IL-1β、IL-33和TNF-α在KOA中后期的過表達。在骨性關(guān)節(jié)炎的進展的后期，脊髓內(nèi)NF-κB/p65增加了大鼠的痛覺敏感程度有可能是通過上調(diào)IL-1β、IL-33和TN