核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、藥物篩選模型是尋找和發(fā)現(xiàn)新藥的重要方法之一。近年來，隨著分子生物學(xué)、藥學(xué)及現(xiàn)代色譜技術(shù)等學(xué)科的迅猛發(fā)展，涌現(xiàn)出大量新型的藥物篩選模型。這些新型藥物篩選模型具有篩選方法簡便、篩選過程迅速，并且可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選等特點(diǎn)。
　　近幾年，DNA折紙技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用越來越成熟，DNA折紙主要的優(yōu)點(diǎn)包括具有空間可尋址、生物相容性好、制備過程簡單及表面易于修飾等。本文擬利用DNA折紙以上的特點(diǎn)，將其作為生物載體把核受體PPARγ負(fù)載在其表面，然

2、后采用化學(xué)鍵合的方法將二者的綴合物共價鍵合在無機(jī)材料硅膠表面，最后將硅膠填充于不銹鋼色譜柱中，從而構(gòu)建一種新型基于DNA折紙色譜的藥物篩選模型。
　　首先，以Ecoil. JM109為噬菌體M13 mp18的宿主，通過聚乙二醇沉淀純化，采用酚抽提得到M13mp18 ssDNA，采用瓊脂糖凝膠對其進(jìn)行表征；以BL21(DE3)菌為PPARγ-LBD蛋白的表達(dá)菌株，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、提取、及純化得到PPARγ-LBD蛋白，采用SDS-PA

3、GE電泳對其進(jìn)行表征；在 PCR儀中采用特定的程序，以M13mp18 ssDNA為腳手架鏈，在訂書釘鏈的輔助下，組裝得到DNA折紙結(jié)構(gòu)；DNA折紙結(jié)構(gòu)表面的“捕獲鏈”與PPARγ蛋白表面修飾的DNA鏈通過堿基互補(bǔ)配對將PPARγ組裝到DNA折紙表面，采用瓊脂糖凝膠電泳和AFM對其進(jìn)行表征；以SMCC為交聯(lián)劑，將PPARγ-DNA折紙綴合物鍵合到巰丙基硅膠表面，得到核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜固定相；將此固定相裝填于不銹鋼色譜柱

4、中，完成核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的構(gòu)建。
　　其次，本文對核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜藥物篩選模型的親和性和特異性進(jìn)行了評價。以未組裝核受體PPARγ的色譜柱為陰性對照柱，觀察陽性藥物羅格列酮在陰性對照柱和核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜柱上的保留行為，對本研究構(gòu)建的藥物篩選模型的親和性進(jìn)行評價；以撲熱息痛為陰性藥物，羅格列酮為陽性藥物，觀察二者在核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜柱上的保

5、留行為，對本研究構(gòu)建的藥物篩選模型的特異性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，核受體PPARγ組裝DNA折紙藥物篩選模型能夠?qū)傩缘刈R別羅格列酮。
　　再次，研究核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜藥物篩選模型在中藥人參活性成分篩選中的應(yīng)用。采用PPARγ組裝 DNA折紙色譜柱分析人參總皂苷，分別收集有保留的組分和未保留的組分。利用反相色譜分別對人參總皂苷、人參皂苷與PPARγ相互作用并且作用能力較強(qiáng)的組分主要是人參皂苷Re。
　　最后，

6、本文對核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜藥物篩選模型的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。隨機(jī)選擇三批核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜固定相并裝填成色譜柱，觀察人參皂苷在三批色譜柱上的保留行為，以此來評價核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的重復(fù)性，人參皂苷的分析色譜圖基本一致，說明本研究構(gòu)建的藥物篩選模型重復(fù)性良好；通過觀察人參皂苷在同一色譜柱上的保留行為，來考察核受體 PPARγ組裝 DNA折紙色譜藥物篩選模型的穩(wěn)定性，隨