Let-7f在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與臨床的相關(guān)性及調(diào)控靶基因RAB40C對(duì)細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、本課題實(shí)驗(yàn)分為以下兩部分:
　　第一部分:Let-7f在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性研究
　　目的:
　　檢測(cè)Let-7f在膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及血清中的表達(dá)水平;探討Let-7f表達(dá)水平與患者臨床特征之間的關(guān)系及對(duì)預(yù)后判斷及早期診斷的意義。
　　方法:
　　1、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)108例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及瘤旁非瘤性正常腦組織樣本中Let-7f的表達(dá)情況;檢測(cè)108例膠質(zhì)瘤

2、患者及40例健康對(duì)照者血清中Let-7f的表達(dá)情況。
　　2、分析膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中Let-7f表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理級(jí)別及術(shù)前KPS評(píng)分等臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。
　　3、以Kaplan-Meier生存分析方法研究獲得完整隨訪資料的101例膠質(zhì)瘤患者中腫瘤組織Let-7f表達(dá)水平與患者術(shù)后生存時(shí)間的相關(guān)性。
　　4、以單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小、部位、

3、病理級(jí)別、KPS評(píng)分、Let-7f表達(dá)水平，尋找影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　5、分析不同級(jí)別和組別的膠質(zhì)瘤患者血清Let-7f表達(dá)水平的差異。通過(guò)ROC曲線及ROC曲線下面積(AUC)來(lái)評(píng)估血清Let-7f表達(dá)水平對(duì)不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤的早期診斷價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　1、Let-7f在膠質(zhì)瘤組織及血液中均呈低表達(dá)。
　　108例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織樣本中Let-7f的表達(dá)水平明顯低于正常腦組織（0.45

4、±0.203VS1.09±0.211），兩者間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000);膠質(zhì)瘤患者血清中Let-7f表達(dá)水平較40例健康對(duì)照者血清有明顯降低（0.39±0.201VS0.88±0.260 P＜0.001）。Let-7f在膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的血清樣本中的表達(dá)水平具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2=0.853(P=0.01)。
　　2、膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達(dá)與腫瘤大小、WHO分級(jí)顯著相關(guān)。
　　膠質(zhì)瘤組織中Let

5、-7f的表達(dá)水平在不同腫瘤大小和不同病理級(jí)別患者中有顯著差異，而與其它因素?zé)o明顯相關(guān)性。以Let-7f的平均表達(dá)水平(0.51)為界，所有患者分為高、低水平表達(dá)兩組。70.6％的WHO分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)入低水平表達(dá)組;而Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者中，Let-7f的表達(dá)水平低于均值的僅有35.1％，差異顯著（x2=13.588 P=0.001）。不同WHO分級(jí)的兩組患者Let-7f平均表達(dá)水平者有顯著差異(0.33±0.191 VS0.79±0.

6、20 P＜0.001)。腫瘤直徑在3cm以上的膠質(zhì)瘤患者Let-7f低表達(dá)比例及Let-7f平均表達(dá)水平與腫瘤直徑在3cm以下患者有顯著差異(x2=8.306 P=0.004;0.38±0.193VS0.69±0.198 P＜0.01)。
　　3、膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達(dá)水平越低，患者術(shù)后生存時(shí)間越短。
　　Kaplan-Meier生存分析方法顯示:獲得完整隨訪資料的101例膠質(zhì)瘤患者中腫瘤組織Let-7f呈低表達(dá)水平

7、的患者術(shù)后生存時(shí)間明顯短于高表達(dá)組患者(24.1month VS34.5 month)，Log rank檢驗(yàn)顯示兩組有顯著性差異(P=0.000)。47例WHO分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)患者中，Let-7f低表達(dá)組的患者術(shù)后中位生存時(shí)間與高表達(dá)組患者差異顯著（13.2month VS24.5 month P＜0.001）。而在54例Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者中，Let-7f低表達(dá)組患者的術(shù)后中位生存時(shí)間與高表達(dá)組患者并無(wú)顯著性差異(37.3month VS41.7

8、 monthP＞0.05)。
　　4、Let-7f是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　單因素分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，KPS評(píng)分＜80分、WHO分級(jí)增高和腫瘤組織中Let-7f低表達(dá)均是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素。運(yùn)用單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，KPS評(píng)分、WHO分級(jí)和腫瘤組織中Let-7f表達(dá)水平均是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素指標(biāo)。KPS評(píng)分越低、WHO分級(jí)越高和以及腫瘤組織中Let-7f表達(dá)水平越低，

9、則患者的預(yù)后越差。顯示Let-7f的表達(dá)與預(yù)后顯著相關(guān)，是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=1.971，95％CI=1.381-2.813，P=0.000)。
　　5、膠質(zhì)瘤患者血清Let-7f表達(dá)水平對(duì)惡性膠質(zhì)瘤早期診斷具有一定意義。
　　膠質(zhì)瘤患者的血清Let-7f表達(dá)水平與WHO分級(jí)密切相關(guān)（P＜0.001）。所有級(jí)別膠質(zhì)瘤的AUC為0.719(95％ CI，0.653-0.828)。血清Let-7f的臨界值為1

10、.50，相應(yīng)的敏感度和特異度分別為53.6％和82.1％。高級(jí)別膠質(zhì)瘤AUC為0.795(95％ CI，0.688-0.901)，提示Let-7f對(duì)惡性膠質(zhì)瘤早期診斷具有一定意義。
　　結(jié)論:
　　膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及血液中Let-7f均呈現(xiàn)低表達(dá)。Let-7f可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)判定膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后分析帶來(lái)幫助，并對(duì)惡性膠質(zhì)瘤具有一定的早期診斷價(jià)值。
　　第二部分:Let-7f通過(guò)靶基因RAB40C抑制膠

11、質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　目的:
　　檢測(cè)Let-7f在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和正常星形細(xì)胞中的表達(dá)情況;尋找并驗(yàn)證Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的下游靶基因，探討Let-7f通過(guò)靶基因調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、應(yīng)用RT-qPCR方法檢測(cè)Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G和正常星型細(xì)胞中的的表達(dá)水平。
　　2、通過(guò)Lipofectamine2000瞬時(shí)

12、轉(zhuǎn)染技術(shù)將Let-7fmimics、Let-7finhibitor分別轉(zhuǎn)染入A172、T98G。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，以細(xì)胞轉(zhuǎn)染作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間分別為細(xì)胞生長(zhǎng)的第24、48、72、96小時(shí)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化。
　　3、檢索miRBase、Targetscan、microRNAs等數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找Let-7f的目標(biāo)靶基因。運(yùn)用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞

13、進(jìn)行檢測(cè)，研究抑制和過(guò)表達(dá)Let-7f對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證尋找到的靶基因是否為L(zhǎng)et-7f的下游目標(biāo)靶基因。
　　4、分別干擾和過(guò)表達(dá)Let-7f及靶基因RAB40C，并分為4組進(jìn)行比較:A組:control、siRNA-Let-7f、si-RAB40C、siRNA-Let-7f+si-RAB40C;B組:control、Let-7fmimics、pEGFP-C1-RAB40C、Let-7fmi

14、mics+pEGFP-C1-RAB40C;C組:control、siRNA-Let-7f、pEGFP-C1-RAB40C、siRNA-Let-7f+ pEGFP-C1-RAB40C;D組:control、Let-7fmimics、si-RAB40C、Let-7fmimics+si-RAB40C。采用CCK-8法對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行增殖能力檢測(cè)，通過(guò)比較分析Let-7f及其靶基因RAB40C在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活動(dòng)中的分子作用機(jī)制。
　　結(jié)果

15、:
　　1、Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)
　　Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G中的表達(dá)水平明顯低于正常星型細(xì)胞中的的表達(dá)(P＜0.01），選擇表達(dá)最低的A172、T98G進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖
　　Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法成功將Let-7fmimics、Let-7finhibitor轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞A

16、172、T98G，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率滿(mǎn)意。轉(zhuǎn)染Let-7fmimics后細(xì)胞增殖能力比轉(zhuǎn)染Let-7fmimicsNC或未轉(zhuǎn)染組明顯降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示G0期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少;而轉(zhuǎn)染Let-7finhibitor后細(xì)胞的增殖能力顯著升高，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示G0期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3、Let-7f功能靶基因?yàn)镽AB40C
　　搜索數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)R

17、AB40C的3'UTR與Let-7f存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Let-7fmimics、Let-7finhibitor結(jié)果顯示:相比于未轉(zhuǎn)染組、Let-7fmimicsNC組，Let-7fmimics組的RAB40C表達(dá)水平降幅明顯(P＜0.001)。雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染野生型RAB40C表達(dá)載體與Let-7fmimics后，熒光素酶相對(duì)活性明顯下降(P＜0.01）;而共轉(zhuǎn)染野生型RAB40C表達(dá)載體與L